土壤磷酸酶的分光法測定方案
土壤磷酸酶的分光法測定方案
引言
磷酸酶能酶促有機磷化合物的水解。試驗表明，土壤微生物對于土壤含磷有機物的礦化起著主要的作用;某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力狀況（特別是磷的狀況)。
原理
土壤磷酸酶活性的測定常用各種磷酸酯作為基質(zhì)。應(yīng)用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、a-或B-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性鈉鹽。當(dāng)它們被酶促水解時，能析出無機磷和基質(zhì)的有機基團。因此磷酸酶活性的測定時測定基質(zhì)水解后的無機磷或酚的部分。這里介紹的方法是測定基質(zhì)水解時生成的酚量。該法可用于測定各種磷酸酶的活性:堿性磷酸酶（用PH10的硼酸鹽緩沖液)，中性磷酸酶（用PH7.0的檸檬酸鹽緩沖液)，酸性磷酸酶（用PH5.0的乙酸鹽緩沖液)
儀器及試劑
1)甲苯
2)0.5%磷酸苯二鈉
3）硼酸鹽緩沖液（PH9.6與PH10.0):稱取12.404g硼酸(H,BO;）溶于700ml去離子水，
用稀NaOH溶液調(diào)節(jié)至PH10.0，用去離子水稀釋至1000ml
4)氯代二溴對苯酮亞胺試劑:取0.125g 2,6-二溴苯酮氯酰亞胺，用10ml 96%的乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。
5）標(biāo)準(zhǔn)溶液:(a）母液: 1g 酚溶于蒸餾水中，并稀釋至1000ml，溶液保存在暗色瓶中;
(b）工作液: 10ml溶液（a）稀釋至1000ml ( 1ml含10ug酚>
6)0.3%硫酸鋁溶液
標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制
取1，3，5，7，9，11和 13ml酚工作液(b)，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml緩沖液和4滴氯代二溴對苯酮亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度，30min后比色測定。以光密度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
操作步驟
1）取5g 風(fēng)干土置于200ml 三角瓶中，用2.5ml甲苯處理2）處理15min后，加入20ml 0.5%磷酸苯二鈉
3)將反應(yīng)混合物置于37℃恒溫箱中，培養(yǎng)24h后，在培養(yǎng)液中加100ml 0.3%硫酸鋁溶液用致密濾紙過濾。
4)無土對照:不加土樣，其他操作與樣品實驗相同。以檢驗試劑純度，整個實驗設(shè)置一個對照
5)無基質(zhì)對照:對每個土樣，設(shè)置以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同。6）比色程序:
取濾液3ml置于50ml容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線所述方法顯色。用硼酸緩沖液時，呈現(xiàn)藍色，在分光光度計上于660nm處比色。
結(jié)果計算
磷酸酶活性，以24h后1g土壤中釋出的酚的毫克數(shù)表示:
酚(mg) =a ×8
式中，a——從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的酚毫克數(shù)
8——換算成1g土的系數(shù)
以24h后1g土壤中釋放出的酚的質(zhì)量（mg）表示磷酸酶活性。
磷酸酶活性=(a樣品一a無土一a無基質(zhì)）×V×n/m
式中:a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù);
a無土為無土對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù);
a無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù);
V為顯色液體積;
n為分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積;
m表示烘干土重
儀器參數(shù)
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上海美析儀器公司簡介
上海美析儀器有限公司(以下簡稱美析)，是一家具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高新技術(shù)企業(yè)，美析的創(chuàng)業(yè)理念“科技——因你改變”，并以此為企業(yè)宗旨，不斷探究、果敢創(chuàng)新。特別是在分析測試儀器領(lǐng)域，不斷開發(fā)出先進的產(chǎn)品，使美析成為優(yōu)質(zhì)儀器資源的供應(yīng)者。
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（美析儀器不僅僅只是一家高新技術(shù)認(rèn)證企業(yè)，更通過了CE認(rèn)證、FCC認(rèn)證、RoHS認(rèn)證以及國內(nèi)多項資質(zhì)審查認(rèn)證，并有著多項自行研發(fā)的光譜類專利版權(quán)等等）
