豆制品中堿性橙2的測定

1 范圍

     本方法規(guī)定了豆制品中堿性橙2的高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定方法。

本方法適用于豆腐、豆干、腐竹、豆皮、油炸豆腐中堿性橙2的測定和確證。

2 原理

試樣經(jīng)水-乙酸-乙酸銨-乙腈超聲萃取，提取液于-20 ^oC冷凍分層，離心去除少量脂質(zhì)類雜質(zhì)，酸化后以混合型陽離子交換固相萃取柱凈化，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定和確證，外標法定量。

3 試劑和材料

       除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。

3.1 試劑

3.1.1 乙腈（CH₃CN) ：色譜純。

3.1.2 甲醇（CH₃OH) ：色譜純。

3.1.3 甲酸（HCOOH) ：色譜純。

3.1.4 甲酸銨（HCOONH₄) ：色譜純。

3.1.5 氯化鈉（NaCl）：分析純。

3.1.6 冰乙酸（CH₃COOH）：分析純。

3.1.7 乙酸銨(CH₃COONH₄)：分析純。

3.1.8 0.4 %乙酸-20 mmol/L乙酸銨水溶液：精確稱取乙酸銨0.77 g，移取冰乙酸2 mL，用水溶解并定容至500 mL。

3.1.9 0.1%甲酸-10 mmol/L甲酸銨水溶液：精確稱取甲酸銨0.32 g，移取甲酸0.5 mL，用水溶解并定容至500 mL。

3.2 標準品

堿性橙2：中文別名王金黃，英文名稱Chrysoidine，CAS號:532-82-1，分子式C₁₂H₁₂N₄·HCl，分子量248.72，純度≥95%。

3.3 標準溶液配制

3.3.1 標準儲備液：準確稱取適量堿性橙2標準品，用少量50%乙腈水溶解，再用乙腈定容，制成1000 mg/L標準儲備液，-18℃以下保存，標準儲備液在12個月內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.2 空白基質(zhì)溶液：按照6.1規(guī)定的樣品預處理方法操作制備。

3.3.3 標準系列工作液：用空白基質(zhì)溶液（3.3.2）將標準儲備液（3.3.1）稀釋成0.5 μg/L 、1.0 μg/L、5.0 μg/L、10.0 μg/L、15.0 μg/L作為液相-質(zhì)譜/質(zhì)譜標準工作液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

3.4 材料                 

3.4.1 Oasis MCX固相萃取小柱：60 mg/3 mL，或性能相當者。使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水進行活化。

3.4.2 聚四氟乙烯濾膜：0.22 μm。

3.4.3 具塞塑料離心管：50 mL、 15 mL。

4 儀器和設(shè)備

4.1 超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源（ESI）。

4.2 電子天平：感量為0.000 1 g和0.01 g。

4.3 漩渦混合器。

4.4 超聲波清洗器。

4.5 低溫離心機：轉(zhuǎn)速不低于5000 r/min。

4.6 組織搗碎機。

5 試樣制備與保存

       將固體樣品充分粉碎混勻，試樣于 -18℃以下冷凍保存。

6 分析步驟

6.1 樣品預處理

6.1.1 提取

稱取1 g（精確到0.01 g）干燥試樣或2g含水試樣于50 mL塑料離心管內(nèi)，加入2.5 mL0.4 %乙酸-20 mmol/L乙酸銨水溶液（3.1.8）混勻、加入10 mL乙腈，渦旋混勻15 s，超聲萃取30 min，靜置分層，4oC下9000 r/min離心10 min，取上清液于50 mL離心管內(nèi)。殘渣中再按上述步驟復提取一次，合并上清液。

6.1.2 凈化

6.1.2.1 -20°C冷凍、離心

提取液中加入約0.5 g 氯化鈉，于-20oC冷凍2 h，分層，取出后4oC下9000 r/min離心5 min，上層乙腈待過固相萃取柱凈化或直接用于LC-MS/MS測定。

6.1.2.2 過固相萃取柱

取乙腈提取液（6.1.2.1）10 mL，加入200 μL甲酸酸化，過Oasis MCX固相萃取小柱（3.4.1），用5mL甲醇淋洗，然后將固相萃取柱抽干，用3 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫目標化合物，收集洗脫液，35℃氮吹濃縮至近干，用2.0 mL 80%乙腈-水溶液溶解，9000 r/min離心5 min或過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜，LC-MS/MS測定。

6.2 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀器測定參考條件

6.2.1 超高效液相色譜條件

a) 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈，1.7 μm，2.1 mm × 100 mm，或性能相當者；

b) 流動相：A為0.1%甲酸-10mmol甲酸銨水溶液（3.1.9），B為乙腈（3.1.1），梯度洗脫條件見表1；

c) 流速：0.3 mL/min；

d) 柱溫：40°C；

e) 進樣量：5 μL。

表1  超高效液相色譜梯度洗脫條件

6.2.2 質(zhì)譜條件

a) ESI(+)離子源。

b) 毛細管電壓：2.8 kV。

c) 離子源溫度：150°C。

d) 脫溶劑氣溫度：400°C。

e) 脫溶劑氣流量：800 L/h。

f) 特征離子見表2。

表2  堿性橙2的定性離子、定量離子、錐孔電壓和碰撞能量

注：* 為定量離子；對不同質(zhì)譜儀器，儀器參數(shù)可能存在差異，測定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。

6.3 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測定

6.3.1 定性測定

各測定目標化合物的定性以保留時間和特征離子對/定性離子對所對應(yīng)的LC-MS/MS色譜峰的相對豐度進行。要求樣液中目標化合物的質(zhì)量色譜峰保留時間與標準溶液一致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)），同時樣液中目標化合物的兩對離子對應(yīng)LC-MS/MS色譜峰豐度比與標準溶液相對豐度比一致，相對離子豐度（k）的允許偏差范圍見表3，則可判斷樣品中存在對應(yīng)的被測物。

表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

6.3.2 定量測定

本方法采用基質(zhì)匹配外標曲線定量，得到目標物濃度與峰面積的工作曲線。

將試樣溶液按儀器參考條件（6.2）進行測定，得到相應(yīng)的樣品溶液的色譜峰面積。根據(jù)標準工作曲線得到待測液中組分的濃度，平行測定次數(shù)不少于兩次。試樣待測液響應(yīng)值若超出標準曲線線性范圍，應(yīng)用基質(zhì)提取液稀釋后進行分析。

標準品、樣品加標液相色譜圖參見附錄A的圖A.1-A.2。

7 結(jié)果計算

結(jié)果按式（1）計算：

…………………………………………（1）

式中：

X—試樣中某種組分的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；

c—由標準曲線得出的樣液中某種組分的濃度，單位為微克每升（μg/L）；

V—試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；

m—試樣稱取的質(zhì)量，單位為克（g）；

計算結(jié)果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

8 檢測方法的精密度、靈敏度、準確度

8.1 精密度

在重復條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

8.2 靈敏度

本方法的檢出限為1.3 μg/kg，定量限為4 .0 μg/kg。

8.3 準確度

本方法在4~100μg/kg添加濃度范圍內(nèi)，腐竹中堿性橙2回收率為86.6%～89.5%；豆腐干中堿性橙2回收率為95.4%～100.8%；豆皮中堿性橙2回收率為90.3%～97.1%；油炸豆腐中堿性橙2回收率為76.2%～80.0%。

9 其他注意事項

9.1 固體樣品需充分粉碎，加入2.5 mL0.4 %乙酸-20mmol/L乙酸銨水溶液使其溶脹，堿性橙2與乙酸銨可形成離子對，有利于乙腈提??；含水量較多的豆腐可增加取樣量為2g。

9.2 超高效液相色譜流動相0.1%甲酸中加入10mmol甲酸銨，可改善堿性橙2色譜峰形，避免溶劑化效應(yīng)引起的不對稱色譜峰。

9.3 對于豆腐、豆干、腐竹、豆皮等基質(zhì)的豆制品，凈化至（6.1.2.1），即可直接上樣；對于油炸豆腐等基質(zhì)的豆制品，需進一步凈化至（6.1.2.2），方可上樣。

9.4 如實驗室不具備聚四氟乙烯濾膜（0.22 μm）可采用高速離心9000 r/min離心5 min的方式處理進樣液。

附錄A

堿性橙2多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖

圖A.1 堿性橙2標準溶液多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖（10 μg/L）

          圖A.2 豆制品中堿性橙2加標樣品多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖（10 μg/kg）       

本方法負責起草單位：北京市疾病預防控制中心。

驗證單位：北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心、成都市食品藥品檢驗研究院、遼寧省食品檢驗檢測院、山東省食品藥品檢驗研究院、四川省食品藥品檢驗檢測院。

主要起草人：趙珊、丁曉靜、張晶、邵兵