飲料、茶葉及相關制品中二氟尼柳等18種化合物的測定
1 范圍
本方法規(guī)定了飲料、茶葉及相關制品中二氟尼柳等18種抗風濕類化合物的液相色譜-串聯(lián)質譜測定方法。
本方法適用于飲料、茶葉及相關制品中二氟尼柳等18種抗風濕類化合物的測定，其他基質可參照本方法定性檢測。
2 原理
試樣經甲醇水溶液提取，稀釋后采用液相色譜-串聯(lián)質譜儀檢測，外標法定量。
3 試劑和材料
除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的一級水。
3.1 試劑
3.1.1 乙腈（CH3CN）：色譜純。
3.1.2 甲醇（CH3OH）：色譜純。
3.1.3 甲酸（HCOOH）：色譜純。
3.1.4 乙酸銨（CH3COONH4）：優(yōu)級純或相當者。
3.2 溶液配制
3.2.1 含0.05 %甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液：稱取0.154 g乙酸銨（3.1.4），加入適量水溶解, 再加入0.5 mL甲酸（3.1.3），用水定容至1000mL。
3.2.2 甲醇水溶液（4+1）：準確量取400 mL甲醇（3.1.2）和100 mL水，混勻后備用。
3.3 標準品
二氟尼柳、美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、醋氯芬酸、貝諾酯、依托考昔、萘普生、芬布芬、奧沙普秦、尼美舒利、氟比洛芬、雙氯芬酸鈉、依托度酸、吲哚美辛、萘丁美酮、非普拉宗、塞來昔布標準品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量詳見附錄A中的表A.1，各標準品純度均≥95%。
3.4 標準溶液的配制
3.4.1 標準儲備液(500 μg/mL)：準確稱取各標準品（3.3）50.0 mg（精確至0.0001 g），分別置于100 mL容量瓶中，美洛昔康加5mL水溶解，再用甲醇（3.1.2）稀釋至刻度，其余標準品用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度各為500 μg /mL標準儲備液，-20℃保存，有效期3個月。
3.4.2 混合標準中間液A（1 μg/mL）：分別準確吸取0.2 mL美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、貝諾酯、依托考昔、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、依托度酸、非普拉宗各標準儲備溶液（3.4.1），置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.2）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為1 μg/mL的混合標準中間液A，-20℃保存，有效期1個月。
3.4.3 混合標準中間液B（5 μg/mL）：分別準確吸取1.0 mL二氟尼柳、醋氯芬酸、萘普生、芬布芬、尼美舒利、氟比洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、塞來昔布各標準儲備溶液（3.4.1），置于同一100 mL容量瓶中，用甲醇（3.1.2）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為5 μg/mL的混合標準中間液B，-20 ℃保存，有效期1個月。
3.4.4 混合標準系列工作溶液：分別準確吸取混合標準中間液A和B適量，置于同一容量瓶中，用甲醇（3.1.2）稀釋配制成系列標準工作溶液S1~S5?；旌蠘藴手虚g液A（3.4.2）中各化合物濃度為2ng/mL、4ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL；混合標準中間液B（3.4.3）中各化合物濃度為10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、200ng/mL；臨用新制或依儀器響應情況配制適當濃度的混合標準工作溶液。
3.5 微孔濾膜：0.22 μm，有機相。
4 儀器和設備
4.1 高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀，配有電噴霧離子源（ESI源）。
4.2 粉碎機。
4.3 電子天平：感量分別為0.0001 g和0.01 g。
4.4 超聲波水浴。
5 試樣制備
5.1 飲料
充分混勻，直接取用。
5.2 茶葉及相關制品
取適量有代表性的試樣，粉碎機粉碎后過40目篩，裝入潔凈容器中，密封并標記。
6 分析步驟
6.1 樣品提取
6.1.1 飲料
準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2），搖勻（固體飲料需充分溶解），再用甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2）定容至刻度，混勻，經 0.22 μm濾膜過濾，取濾液，根據實際濃度適當?shù)南♂屩凉ぷ髑€線性范圍內，供高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定。
6.1.2 茶葉及相關制品
準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣置于25 mL容量瓶中，加入20 mL甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2），搖勻，超聲30 min，冷卻至室溫后，用甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2）定容至刻度，混勻靜置10 min，準確吸取2 mL上清液至10 mL容量瓶中，用甲醇-水溶液（4+1）（3.2.2）定容至刻度，混勻，經 0.22 μm濾膜過濾，取濾液，根據實際濃度適當?shù)南♂屩凉ぷ髑€線性范圍內，供高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定。
6.2 測定
6.2.1 儀器參考條件
6.2.1.1 液相色譜條件
a) 色譜柱：C18柱，100 mm× 2.1 mm，粒徑 2.2 μm，或性能相當者。
b) 流動相：A為乙腈（3.1.1），B為含0.05 %甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液（3.2.1），梯度洗脫程序見表1。
c) 流速：0.3 mL/min。
d) 柱溫：35 ℃。
e) 進樣量：2 μL。
表1 梯度洗脫程序
|
時間 (min) |
流動相A（%） |
流動相B（%） |
|
0 |
5 |
95 |
|
1 |
5 |
95 |
|
11 |
95 |
5 |
|
13 |
95 |
5 |
|
14 |
5 |
95 |
|
16 |
5 |
95 |
6.2.1.2 質譜條件
a) 離子源：電噴霧離子源（ESI源）。
b) 檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）。
c) 掃描方式：正離子模式和負離子模式。
d) 氣簾氣（CUR）、霧化氣（GS1）、輔助氣（GS2）、碰撞氣（CAD）均為高純氮氣或其他合適氣體，使用前應調節(jié)相應參數(shù)使質譜靈敏度達到檢測要求，電噴霧電壓（IS）、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)使用前應優(yōu)化至最佳靈敏度，監(jiān)測離子對和定量離子對等信息詳見附錄B。
6.2.2 定性測定
按照上述條件測定試樣和混合標準工作液，如果試樣中的質量色譜峰保留時間與混合標準工作液中的某種組分一致（變化范圍在±2.5%之內）；試樣中定性離子對的相對豐度與濃度相當?shù)幕旌蠘藴使ぷ饕旱南鄬ωS度一致，相對豐度（k）偏差不超過表2規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。
表2 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差
|
相對離子豐度（%） |
k>50% |
50%≥k>20% |
20%≥k>10% |
k≤10% |
|
允許的相對偏差（%） |
±20 |
±25 |
±30 |
±50 |
6.2.3 定量測定
將混合標準系列工作溶液（3.4.4）按儀器參考條件（6.2.1）進行測定。以混合標準系列工作溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。若試樣檢出與混合標準系列工作溶液一致的化合物，根據標準工作曲線按外標法以峰面積計算得到其含量。
二氟尼柳等18種標準物質色譜圖見附錄 C。
7 結果計算
結果按式（1）計算：
…………………………………………（1）
式中：
X — 試樣中各待測物的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
c — 從標準工作曲線中讀出的供試品溶液中各待測組分的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；
V — 試樣溶液最終定容體積，單位為毫升（mL）；
m — 稱樣量，單位為克（g）；
K — 試樣制備過程中的稀釋倍數(shù)。
計算結果以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的算術平均值表示，結果保留三位有效數(shù)字。
8 檢測方法的靈敏度、準確度、精密度
8.1 靈敏度
當飲料稱樣量為1 g，定容體積為50 mL，本方法中各化合物的定量限如下：
美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、貝諾酯、依托考昔、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、依托度酸、非普拉宗定量限為0.2 mg/kg；二氟尼柳、醋氯芬酸、萘普生、芬布芬、尼美舒利、氟比洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、塞來昔布定量限為1.0 mg/kg。
當茶葉及相關制品稱樣量為1 g，定容體積為125 mL，本方法中各化合物的定量限如下：
美洛昔康、舒林酸、吡羅昔康、貝諾酯、依托考昔、奧沙普秦、雙氯芬酸鈉、依托度酸、非普拉宗定量限為0.5 mg/kg；二氟尼柳、醋氯芬酸、萘普生、芬布芬、尼美舒利、氟比洛芬、吲哚美辛、萘丁美酮、塞來昔布定量限為2.5 mg/kg。
8.2 準確度
本方法在0.2~25 mg/kg添加濃度范圍內，回收率為71%~116%。
8.3 精密度
在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的15 %。
附錄A
二氟尼柳等18種化合物相關信息
表A.1 18種化合物的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號、分子式、相對分子質量
|
序號 |
中文名稱 |
英文名稱 |
CAS登錄號 |
分子式 |
相對分子質量 |
|
1 |
二氟尼柳 |
Diflunisal |
22494-42-4 |
C13H8F2O3 |
250.2 |
|
2 |
美洛昔康 |
Meloxicam |
71125-38-7 |
C14H13N3O4S2 |
351.4 |
|
3 |
舒林酸 |
Sulindac |
38194-50-2 |
C20H17FO3S |
356.41 |
|
4 |
吡羅昔康 |
Piroxicam |
36322-90-4 |
C15H13N3O4S |
331.35 |
|
5 |
醋氯芬酸 |
Aceclofenac |
89796-99-6 |
C16H13Cl2NO4 |
354.18 |
|
6 |
貝諾酯 |
Benorilate |
5003-48-5 |
C17H15NO5 |
313.3 |
|
7 |
依托考昔 |
Etoricoxib |
202409-33-4 |
C18H15ClN2O2S |
358.84 |
|
8 |
萘普生 |
Naproxen |
22204-53-1 |
C14H14O3 |
230.26 |
|
9 |
芬布芬 |
Fenbufen |
36330-85-5 |
C16H14O3 |
254.28 |
|
10 |
奧沙普秦 |
Oxaprozin |
21256-18-8 |
C18H15NO3 |
293.32 |
|
11 |
尼美舒利 |
Nimesulide |
51803-78-2 |
C13H12N2O5S |
308.31 |
|
12 |
氟比洛芬 |
Flurbiprofen |
5104-49-4 |
C15H13FO2 |
244.26 |
|
13 |
雙氯芬酸鈉 |
Diclofenac sodium |
15307-79-6 |
C14H10Cl2NNaO2 |
318.13 |
|
14 |
依托度酸 |
Etodolac |
41340-25-4 |
C17H21NO3 |
287.35 |
|
15 |
吲哚美辛 |
Indometacin |
53-86-1 |
C19H16ClNO4 |
357.79 |
|
16 |
萘丁美酮 |
Nabumetone |
42924-53-8 |
C15H16O2 |
228.29 |
|
17 |
非普拉宗 |
Feprazone |
30748-29-9 |
C20H20N2O2 |
320.39 |
|
18 |
塞來昔布 |
Celecoxib |
169590-42-5 |
C17H14F3N3O2S |
381.37 |
A
A
附錄B
參考質譜條件
a) 離子源：電噴霧離子源（ESI源）；
b) 檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）；
c) 掃描方式：正離子模式和負離子模式；
d) 電噴霧電壓（IS）：5500 V（ES+）；-4500 V（ESI-）；
e) 氣簾氣（CUR）：35 psi；
f) 霧化器（GS1）：55 psi；
g) 輔助氣（GS2）：55 psi；
h) 離子源溫度（TEM）：500 ℃。
表B.1 二氟尼柳等18種化合物定性、定量離子和質譜分析參數(shù)
|
序號 |
化合物名稱 |
電離 |
母離子 |
子離子 |
去簇電壓 |
碰撞能量 |
保留時間 |
|
方式 |
(m/z) |
(m/z) |
(V) |
(V) |
（min） |
||
|
1 |
二氟尼柳 |
ESI- |
248.9 |
204.9* |
60 |
27 |
8.19 |
|
156.9 |
45 |
||||||
|
2 |
美洛昔康 |
ESI+ |
352 |
115.0* |
80 |
22 |
8.41 |
|
141 |
26 |
||||||
|
3 |
舒林酸 |
ESI+ |
357.1 |
233.1* |
105 |
66 |
8.58 |
|
340.1 |
30 |
||||||
|
4 |
吡羅昔康 |
ESI+ |
332 |
164.0* |
80 |
25 |
8.61 |
|
121 |
28 |
||||||
|
5 |
醋氯芬酸 |
ESI- |
354 |
74.9* |
20 |
25 |
8.93 |
|
251.9 |
30 |
||||||
|
6 |
貝諾酯 |
ESI+ |
314.1 |
121.1* |
68 |
20 |
8.96 |
|
272.1 |
11 |
||||||
|
7 |
依托考昔 |
ESI+ |
359 |
280.1* |
160 |
42 |
9.12 |
|
252.1 |
61 |
||||||
|
8 |
萘普生 |
ESI- |
229 |
170.0* |
10 |
22 |
9.42 |
|
185 |
8 |
||||||
|
9 |
芬布芬 |
ESI+ |
255.1 |
181.1* |
50 |
34 |
9.62 |
|
237.1 |
15 |
||||||
|
10 |
奧沙普秦 |
ESI+ |
294.1 |
103.1* |
90 |
42 |
9.93 |
|
276.1 |
23 |
||||||
|
11 |
尼美舒利 |
ESI- |
306.9 |
197.9* |
60 |
36 |
10.15 |
|
228.9 |
24 |
||||||
|
12 |
氟比諾芬 |
ESI- |
243 |
198.9* |
10 |
15 |
10.15 |
|
179 |
20 |
||||||
|
13 |
雙氯芬酸鈉 |
ESI- |
295.9 |
251.9* |
45 |
16 |
10.26 |
|
213.9 |
30 |
||||||
|
14 |
依托度酸 |
ESI- |
286 |
242.0* |
70 |
23 |
10.28 |
|
212 |
33 |
||||||
|
15 |
吲哚美辛 |
ESI- |
356 |
296.9* |
20 |
27 |
10.42 |
|
311.9 |
13 |
||||||
|
16 |
萘丁美酮 |
ESI+ |
229.1 |
128.1* |
70 |
55 |
10.71 |
|
171.1 |
22 |
||||||
|
17 |
非普拉宗 |
ESI+ |
321.1 |
265.1* |
80 |
20 |
10.95 |
|
253.1 |
23 |
||||||
|
18 |
塞來昔布 |
ESI+ |
382 |
362.1* |
110 |
41 |
11.04 |
|
282.1 |
50 |
*定量離子對。
注：（1）方法提供的監(jiān)測離子對等測定條件為推薦條件，各實驗室可根據所配置儀器的具體情況作出適當調整；在樣品基質有測定干擾的情況下，可選用其他監(jiān)測離子對。
（2）為提高檢測靈敏度，可根據保留時間分段監(jiān)測各化合物。
附錄C
二氟尼柳等18種標準物質色譜圖
圖C.2 18種標準物質提取離子色譜圖
本方法負責起草單位：湖北省食品質量安全監(jiān)督檢驗研究院。
驗證單位：大連市食品檢驗所、四川省食品藥品檢驗檢測院、遼寧省食品檢驗檢測院、湖南省食品質量監(jiān)督檢驗研究院、重慶市食品藥品檢驗檢測研究院。
主要起草人：張莉、江豐、黎星、劉迪、余婷婷、唐昌云
