NBT法測(cè)定超氧化物岐化酶(SOD)的應(yīng)用方案(分光法）

NBT法測(cè)定超氧化物岐化酶(SOD)的應(yīng)用方案(分光法）

原理

SOD是含金屬輔基的酶。高等植物含有兩種類(lèi)型的SOD: Mn—sOD和cu.Zn—SOD，它們都催化下列反應(yīng):

由于超氧自由基(O₂）為不穩(wěn)定自由基，壽命極短，測(cè)定SOD活性一般為間接方法。并利用各種呈色反應(yīng)來(lái)測(cè)定SOD的活力。核黃素在有氧條件下能產(chǎn)生超氧自由基負(fù)離子0₂一..一，當(dāng)加入NBT后，在光照條件下，

與超氧自由基反應(yīng)生成單甲攢（黃色)，繼而還原生成二甲攢，它是一種藍(lán)色物質(zhì)，在560nm波長(zhǎng)下有最大吸收。當(dāng)加入SOD時(shí)，可以使超氧自由基與H結(jié)合生成H₂0₂和O₂，從而抑制了NBT光還原的進(jìn)行，使藍(lán)色二甲攢生成速度減慢。

在反應(yīng)液中加入不同量的SOD酶液，光照一定時(shí)間后測(cè)定560nm波長(zhǎng)下各液光密度值，抑制NBT光還原相對(duì)百分率與酶活性在一定范圍內(nèi)呈正比。反應(yīng)液藍(lán)色愈深，說(shuō)明酶活性愈低。

儀器及試劑

美析UV-1500紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)

0.05mol/L磷酸緩沖液(PBS，pH7.8):

A母液:0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液:取 Na2HPO412H2O(分子量358.14)71.7g;B母液:0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液:取NaH2PO4·2H2O(分子量156.01）31.2g。分別用蒸餾水定容到1000ml。

0.05mol/LPBS(pH7.8）的配制:分別取A母液(Na2HPO4)228.75ml，

B母液(NaH₂PO₄)21.25ml，用蒸餾水定容至1000ml。

14.5mM甲硫氨酸溶液:稱(chēng)取1.0818g Met用磷酸緩沖液（pH7.8)定容至500ml。

3mM EDTA-Na2溶液:稱(chēng)取0.1117g EDTA-Na2用磷酸緩沖液定容至100ml。

60 uM核黃素溶液:稱(chēng)取0.0023g核黃素用磷酸緩沖液定容至100ml，避光保存。

2.25mM氮藍(lán)四唑(NBT)溶液:稱(chēng)取0.092g NBT用PBS定容至50ml，避光保存。

實(shí)驗(yàn)步驟

酶液提取

稱(chēng)取0.5g(可視情況調(diào)整）樣品（新鮮葉片或根系）洗凈后置于預(yù)冷研缽中，分三次加入10ml 50mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液( pH7.8)在冰浴上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃、12000g下離心20min，上清夜即為SOD粗提液。

酶活性測(cè)定

(1)反應(yīng)混合液配制(以60個(gè)樣為準(zhǔn)):分別取配好的Met溶液162ml，EDTA-Na₂溶液6ml，NBT溶液6ml，核黃素溶液6ml,混合后充分搖勻;

(2）分別取2.9ml反應(yīng)混合液和0.1ml（可視情況調(diào)整）酶液于指形管中此即反應(yīng)管;同時(shí)做兩支對(duì)照管，其中1支試管加2.9ml反應(yīng)混合液和0.1ml PBS(不加酶液〉作為最大光還原管，另1支加2.9ml反應(yīng)混合液和0.1ml PBS同時(shí)用錫箔紙包好遮光用于測(cè)定時(shí)調(diào)零。

(3）將試管置于光照培養(yǎng)箱中在4000 lux光照25℃下反應(yīng)20min;

(4）反應(yīng)結(jié)束后以不照光的對(duì)照管調(diào)零，分別測(cè)定各管在560nm 下的吸光度（OD560)

計(jì)算結(jié)果

已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活單位(U)，按下式計(jì)算活性n=[(ODmax-OD560)/ODmax]/2

SOD總活性=[(Ack-AE)×V]/(1/2Ack×W×Vt)SOD 比活力=SOD總活性/蛋白質(zhì)含量

SOD總活性以鮮重酶單位每克表示(u/g Fw);比活力單位以酶單位每毫克蛋白表示;

Ack為照光對(duì)照管的吸光度;

AE為樣品管的吸光度;

V為樣品液總體積（ml);

Vt為測(cè)定時(shí)的酶液用量(ml);

W為樣品鮮重(g>;

蛋白質(zhì)含量單位為mg/g。

注意事項(xiàng)

1.酶液提取須在4℃下進(jìn)行，提取后立即進(jìn)行測(cè)定，冰箱中放幾小時(shí)活性也會(huì)下降;

2.植物中的酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾,制備粗酶液時(shí)可加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP）或pvpp 等，盡可能除去植物組織中的酚類(lèi)等次生物質(zhì)。

3.NBT反應(yīng)液配好后過(guò)濾除去不溶物立即使用，若置于冰箱中要避光保存，充分搖勻然后使用。

4．加反應(yīng)液時(shí)最好在暗光下進(jìn)行;

5.核黃素產(chǎn)生O2，NBT還原為藍(lán)甲h都與光照密切相關(guān)，照光強(qiáng)度和時(shí)間要嚴(yán)格控制。光照培養(yǎng)箱內(nèi)壁裱糊錫箔紙，使箱內(nèi)均勻光照約達(dá)40u molms，同時(shí)使照光時(shí)間一樣，選擇試管盡量一致，照光結(jié)束后測(cè)一個(gè)拿一個(gè)（最好晚上做)(溫度高時(shí)照光時(shí)間縮短，溫度低時(shí)延長(zhǎng));

6.測(cè)定活性時(shí)加入的酶量，以能抑制反應(yīng)的50%為佳。(一個(gè)酶單位相當(dāng)于引起反應(yīng)液達(dá)到半抑制時(shí)酶的用量,即以能抑制反應(yīng)50%的酶量為一個(gè) SOD酶活性單位。)

(反應(yīng)液中加酶液與PBS 調(diào)零差異不大，反應(yīng)液調(diào)零與其它兩個(gè)則有一定差異。李合生方法:2支CK管均以緩沖液代替酶液)

儀器參數(shù)

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上海美析儀器公司簡(jiǎn)介

上海美析儀器有限公司(以下簡(jiǎn)稱(chēng)美析)，是一家具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高新技術(shù)企業(yè)，美析的創(chuàng)業(yè)理念“科技——因你改變”，并以此為企業(yè)宗旨，不斷探究、果敢創(chuàng)新。特別是在分析測(cè)試儀器領(lǐng)域，不斷開(kāi)發(fā)出先進(jìn)的產(chǎn)品，使美析成為優(yōu)質(zhì)儀器資源的供應(yīng)者。

      美析主營(yíng)光譜類(lèi)儀器可見(jiàn)分光光度計(jì)、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、原子吸收光譜儀、超微量分光光度計(jì)、原子熒光光度計(jì)、ICP電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、ICP電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，目前，我們的產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)保、冶金、石油、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。同時(shí)美析利用在產(chǎn)品機(jī)械結(jié)構(gòu)、光學(xué)設(shè)計(jì)、電氣應(yīng)用和軟件開(kāi)發(fā)方面積累的豐富經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合市場(chǎng)的最新實(shí)際需求，近期將陸續(xù)推出一批全新的分析類(lèi)儀器。

美析的總部及生產(chǎn)基地設(shè)在上海，營(yíng)銷(xiāo)中心設(shè)在北京，并在江蘇、上海、山東三地建有研發(fā)基地。為充分利用各地的智力資源，美析與國(guó)內(nèi)外的部分科研單位也進(jìn)行了深層次的科研合作，不斷將科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。為更好的服務(wù)于廣大客戶，美析儀器國(guó)內(nèi)設(shè)有12家辦事機(jī)構(gòu)，度身定制符合您需求的應(yīng)用解決方案，提高產(chǎn)品的附加值。在不斷服務(wù)國(guó)內(nèi)用戶的同時(shí)，美析也與20多個(gè)國(guó)家的分銷(xiāo)機(jī)構(gòu)建立了深度的戰(zhàn)略合作關(guān)系。

（美析儀器不僅僅只是一家高新技術(shù)認(rèn)證企業(yè)，更通過(guò)了CE認(rèn)證、FCC認(rèn)證、RoHS認(rèn)證以及國(guó)內(nèi)多項(xiàng)資質(zhì)審查認(rèn)證，并有著多項(xiàng)自行研發(fā)的光譜類(lèi)專(zhuān)利版權(quán)等等）