DNA核酸濃度的測定實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方案（超微量紫外分光法）
DNA核酸濃度的測定實(shí)驗(yàn)應(yīng)用方案（超微量紫外分光法）
引言寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA可以定量溶于緩沖液，構(gòu)成核酸的嘌呤堿和嘧啶堿具有共軛雙鍵，使核苷核和核酸在紫外線光具有特征性的吸收光譜，最大吸收峰為260nm。窄光帶紫外分光光度計(jì)，長260nm．，比色杯光徑1cm，1個(gè)吸光度值（1A）相當(dāng)于50ug/ml雙螺DNA，40ug/ml單螺旋DNA或RNA），20 ug/ml寡核苷酸。
測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
原理紫外分光光度法基于DNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，DNA/RNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在28Onm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，可以用260nm波長進(jìn)行分光測定核酸濃度，OD值為1相當(dāng)于大約50ug/ml雙鏈 DNA，單鏈DNA濃度約為33ug l ml，RNA約為40ug/ml，寡核苷酸約為35ug/ml。如用1cm光徑，用 H,O稀釋DNA/RNA樣品n倍并以H,O為空白對(duì)照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度:
DNA (mg/ml ) =50×OD260 讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000RNA (mg/ml) =40×OD260讀數(shù)×稀釋倍數(shù)/1000。
A280nm是蛋白和酚類物質(zhì)最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估:純DNA的A260/A280比值為1.8，純RNA為2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族)
或分類物質(zhì)的污染，需要純化樣品。比值=1.5相當(dāng)于50%蛋白質(zhì)/DNA溶液。
A230nm是碳水化合物最高吸收峰的吸收波長，比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估:純DNA和RNA的A260/A230比值為2.5。若比值小于2.0標(biāo)明樣品被碳水化合物（糖類）、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品。
A320nm或A340nm為檢測溶液樣品的濁度，該值應(yīng)該接近0.0。假如不足，標(biāo)明溶液中有懸浮物，需要純化樣品。
儀器及試劑
比色杯
樣本DNA
雙蒸水
測定
1、將制備的DNA懸浮溶解于TE緩沖液中 pH8.0，10mmo1L的Tris緩沖液，內(nèi)含(1mmol/L EDTA)或懸浮溶解在滅菌水中(依據(jù)DNA含量加水)。
2、用可掃描的紫外分光光度計(jì)測定制備的DNA/RNA的紫外吸收曲線，測定OD260和OD280，并計(jì)算比值:OD260/OD280，純 DNA的此比值約為1.8~2.0。純RNA的此比值
約為大于2.0。
3、根據(jù)每毫升1微克的純DNA的OD260值=0.020，計(jì)算所得 DNA的純度:每毫升1微克的純RNA的OD260值=0.025，計(jì)算所得RNA的純度。
注意事項(xiàng)
OD值范圍應(yīng)該在0.1~0.99之間，否則不符合上述線性關(guān)系。
A260/A280比值可提供DNA純度的一個(gè)參考，但A260/A280比值會(huì)受pH影響。如果未調(diào)pH，比值可能與實(shí)際差別很大。如果需要準(zhǔn)確數(shù)值，建議在10 mM Tris Cl，pH 8.5中檢測，此時(shí)純凈的 DNA A260/A280比值應(yīng)為1.8-2.0（注意應(yīng)使用同樣緩沖液作為對(duì)照)
在測試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對(duì)測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）。最后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致；不能采用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的最小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
儀器參數(shù)
UL-1000超微量紫外可見分光光度計(jì)產(chǎn)品參數(shù)
1．產(chǎn)品簡介
超微量紫外可見分光光度計(jì)是一類很重要的分析儀器 ,無論在物理學(xué)、化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料學(xué)、環(huán)境科學(xué)等科學(xué)研究領(lǐng)域 ,還是在化工、醫(yī)藥、環(huán)境檢測、冶金等現(xiàn)代生產(chǎn)與管理部門 ,超微量紫外可見分光光度計(jì)都有廣泛而重要的應(yīng)用。超微量紫外可見分光光度計(jì)就是利用分光光度法對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細(xì)菌生長濃度的定量。超微量紫外可見分光光度計(jì)已成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。
2．儀器特點(diǎn)
*檢測所需樣微量，最低只需0.5ul
*檢測范圍寬，比傳統(tǒng)的分光光度計(jì)的上限高100倍
*對(duì)于多數(shù)樣品而言，無需稀釋
*機(jī)器無需預(yù)熱，直接測量，無需檢測容器，日常消耗低
*全波長190-1100nm，分辨率1nm，儀器都自動(dòng)給出全波長的掃描結(jié)果190-850nm
*體積小巧，便攜式包裝，滿足現(xiàn)場檢測的需求
*通過PC控制實(shí)現(xiàn)更精確和靈活的測量
3．技術(shù)指標(biāo)
*最小樣本量：0.5μl
*光程：1mm/0.2mm
*波長范圍：190～850nm
*波長精度：1 nm
*波長分辨率：≤0.3nm（FWHM 在 Hg 253.7nm）
*吸光率精度：2%（0.76 在 257nm）
*吸光率分辨精度：0.002Abs（1mm 光程）
*吸光率范圍：0.02～300 (等效10mm光程)
*可準(zhǔn)確測量范圍：0.1～5 Abs. ±0.1Abs 5～80 Abs. ±2%
*偵測器：3648像素線性CCD陣列
*光源：微型氙氣閃光燈系統(tǒng)
*測量時(shí)間：<5 秒
*尺寸：200mm×130mm×136mm（L×W×H）
*重量：≤ 2.0kg
*樣本檢測平臺(tái)材質(zhì)：304 不銹鋼和石英
*輸入電壓：AC100～240V 50-60Hz
*操作電源功率：24W
關(guān)于我們
上海美析儀器公司簡介
上海美析儀器有限公司(以下簡稱美析)，是一家具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高新技術(shù)企業(yè)，美析的創(chuàng)業(yè)理念“科技——因你改變”，并以此為企業(yè)宗旨，不斷探究、果敢創(chuàng)新。特別是在分析測試儀器領(lǐng)域，不斷開發(fā)出先進(jìn)的產(chǎn)品，使美析成為優(yōu)質(zhì)儀器資源的供應(yīng)者。
美析主營光譜類儀器可見分光光度計(jì)、紫外可見分光光度計(jì)、原子吸收光譜儀、超微量分光光度計(jì)、原子熒光光度計(jì)、ICP電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀、ICP電感耦合等離子體質(zhì)譜儀，目前，我們的產(chǎn)品已廣泛應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)、無機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥、環(huán)保、冶金、石油、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。同時(shí)美析利用在產(chǎn)品機(jī)械結(jié)構(gòu)、光學(xué)設(shè)計(jì)、電氣應(yīng)用和軟件開發(fā)方面積累的豐富經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合市場的最新實(shí)際需求，近期將陸續(xù)推出一批全新的分析類儀器。
美析的總部及生產(chǎn)基地設(shè)在上海，營銷中心設(shè)在北京，并在江蘇、上海、山東三地建有研發(fā)基地。為充分利用各地的智力資源，美析與國內(nèi)外的部分科研單位也進(jìn)行了深層次的科研合作，不斷將科研成果轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力。為更好的服務(wù)于廣大客戶，美析儀器國內(nèi)設(shè)有12家辦事機(jī)構(gòu)，度身定制符合您需求的應(yīng)用解決方案，提高產(chǎn)品的附加值。在不斷服務(wù)國內(nèi)用戶同時(shí)，20多個(gè)國家的分銷機(jī)構(gòu)建立了深度的戰(zhàn)略合作關(guān)系。
（美析儀器不僅僅只是一家高新技術(shù)認(rèn)證企業(yè)，更通過了CE認(rèn)證、FCC認(rèn)證、RoHS認(rèn)證以及國內(nèi)多項(xiàng)資質(zhì)審查認(rèn)證，并有著多項(xiàng)自行研發(fā)的光譜類專利版權(quán)等等）
