分光光度法檢測(cè)葡萄酒中花青素方法可行性分析
關(guān)鍵詞:分光光度法;葡萄酒;花青素；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；美析集團(tuán)（macylab.com）
一、引言
花青素是一類(lèi)廣泛存在于植物中的水溶性色素,屬于黃酮類(lèi)化合物,結(jié)構(gòu)中母核為2-苯基苯并吡喃,是葡萄酒中主要的呈色物質(zhì)。植物中的花青素常與單糖結(jié)合形成花色苷,葡萄酒中花青素以花色苷的形式存在。葡萄酒中主要含有4種花青素:飛燕草色素、矢車(chē)菊色素、芍藥色素和錦葵色素。目前葡萄酒中花青素的檢測(cè)方法有液相色譜法、pH示差分光光度法、分光光度法等。由于液相色譜法的標(biāo)準(zhǔn)品比較昂貴,且花青素標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定,因此限制了該方法的廣泛使用。本研究通過(guò)分析標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的全波長(zhǎng)掃描圖,確定分光光度法的最佳檢測(cè)波長(zhǎng);通過(guò)檢測(cè)不同儲(chǔ)存時(shí)間標(biāo)準(zhǔn)品吸光值,分析標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性,優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液最佳使用時(shí)間;通過(guò)檢測(cè)加標(biāo)回收率、檢出限、定量限等參數(shù),同時(shí)與液相色譜法的數(shù)據(jù)作對(duì)比,分析該方法的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性,對(duì)分光光度法檢測(cè)葡萄酒中花青素方法的可行性進(jìn)行分析。
二、材料與方法
2.1材料、試劑與儀器
實(shí)驗(yàn)用葡萄酒為市售瓶裝葡萄酒。
飛燕草色素(純度98%)、矢車(chē)菊色素(純度98.3%)、芍藥色素(純度98%)、錦葵色素(純度97%);矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度98.43%);鹽酸(優(yōu)級(jí)純)、亞硫酸鈉(優(yōu)級(jí)純)、檸檬酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純);無(wú)水乙醇、甲醇、甲酸(色譜純)。
液相色譜儀(帶二級(jí)管陣列檢測(cè)器)；
電位滴定儀;
數(shù)顯恒溫水浴鍋;
C18液相色譜柱(柱長(zhǎng)250mm,內(nèi)徑4.6mm)
2.2實(shí)驗(yàn)方法
2.2.1分光光度法檢測(cè)葡萄酒中花青素
用0.1mol/L檸檬酸水溶液溶解配制矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品母液,濃度為200μg/mL;
標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液配制:用0.1mol/L檸檬酸水溶液將標(biāo)準(zhǔn)品母液分別稀釋成濃度為1、2、4、8、16、20μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液;
空白試劑:量取5mL0.1mol/L檸檬酸水溶液于10mL比色管中,加入0.5mL10%亞硫酸鈉溶液,用0.1mol/L檸檬酸水溶液稀釋至10mL。以試劑空白調(diào)零,在波長(zhǎng)518nm處測(cè)吸光值,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。量取2mL樣品于50mL容量瓶中,加0.1mol/L檸檬酸水溶液稀釋并定容,靜置10min。取7mL上述樣品溶液于10mL比色管中,加入2mL10%亞硫酸鈉溶液,用0.1mol/L檸檬酸水溶液稀釋并定容至10mL,在波長(zhǎng)518nm處測(cè)定吸光值。將樣品吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中,計(jì)算樣品花青素含量。
2.2.2加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)
向2mL樣品中分別加入濃度為200μg/mL標(biāo)準(zhǔn)品母液0.4、0.8、1.2mL,加標(biāo)水平分別為4、8、12mg/100mL。
每個(gè)水平做6次平行。
2.2.3檢出限及定量限
測(cè)11次樣品空白溶液的吸光值,按GB/T5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗(yàn)方法理化部分總則》的方法計(jì)算檢出限及定量限。
2.2.4pH值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液吸光值的影響
分別測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液和樣品溶液的pH值。配制5份8μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用0.4mol/L的氫氧化鈉分別將5份標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH調(diào)到1.98、2.00、2.04、2.07、2.13、2.20并測(cè)量吸光值。
2.2.5標(biāo)準(zhǔn)品母液的穩(wěn)定性
分別于標(biāo)準(zhǔn)品母液配制完成后第0、1、2、3、4、5、6d測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品吸光值,每次測(cè)定之前將母液稀釋為濃度為8μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品使用液,現(xiàn)用現(xiàn)配。
2.2.6液相色譜法測(cè)定葡萄酒中4種花青素
用10%鹽酸-甲醇溶液(V:V)配制飛燕草色素、矢車(chē)菊色素、芍藥色素和錦葵色素的混標(biāo)母液,濃度為50μg/mL,用10%鹽酸甲醇溶液將混標(biāo)母液分別稀釋成濃度為0.5、1、5、10、25、50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液,過(guò)0.45μm濾膜后用液相色譜分析。
量取5mL樣品于50mL水解管中,加入20mL乙醇水-鹽酸(2:1:1,V:V:V)溶液,搖勻后于沸水浴中水解1h,取出冷卻后用乙醇-水-鹽酸(2:1:1,V:V:V)溶液定容至25mL。過(guò)0.45μm濾膜后用液相色譜分析。液相色譜儀器條件參照NY/T2640-2014《植物源性食品中花青素的測(cè)定高效液相色譜法》。
三、結(jié)果與分析
3.1方法檢測(cè)波長(zhǎng)的選定使用分光光度計(jì)分析葡萄酒中的花青素含量。由圖1可見(jiàn)矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的最大吸收波長(zhǎng)為512nm;由圖2可見(jiàn)樣品的最大吸收波長(zhǎng)為522nm。因此將檢測(cè)波長(zhǎng)定為518nm。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長(zhǎng)有偏差,是因?yàn)槠咸丫浦谐噬镔|(zhì)為花色苷的混合物，而且除了花色苷外還含有其他呈色物質(zhì)。因此要通過(guò)扣除樣品空白來(lái)排除其他呈色物質(zhì)的影響,樣品空白中加入亞硫酸鈉是為了去除樣品中的花青素,亞硫酸鈉可以和花青素反應(yīng),生成無(wú)色化合物,使花青素在518nm附近的特征吸收消失。加入亞硫酸鈉后樣品空白溶液仍然有顏色,這些顏色主要來(lái)源于其他呈色物質(zhì)。
3.2花青素中pH對(duì)吸光值的影響
花色苷的結(jié)構(gòu)會(huì)隨著pH值的改變而變化,溶液pH不同,花色苷的存在形式也不同?；ㄉ赵谌芤褐幸?span>4種結(jié)構(gòu)存在:藍(lán)色的醌式堿、紅色的花烊正離子、無(wú)色的甲醇假堿和查爾酮。同一pH時(shí)可使這4種結(jié)構(gòu)的化合物比例達(dá)到平衡。花色苷在pH值較低時(shí),溶液的顏色為較深的紅色。隨著pH值的增加花色苷的顏色逐漸變淺,最終將變?yōu)闊o(wú)色。因此在使用分光光度法時(shí)需要考慮pH對(duì)花色苷吸光值的影響,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液和樣品溶液的pH值偏差不能太大。表1為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液和樣品溶液的pH值,由表1可以看出,樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的pH值差異不顯著(P>0.05),表2為pH值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光值的影響,由表2可以看出,隨著溶液pH的增加,標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值顯著降低。但是pH為1.98、2.00和2.04時(shí)吸光值差異不顯著(P>0.05),用檸檬酸溶液提取后樣品pH小于2.07,因此樣品溶液pH值對(duì)吸光值影響較小。與毛建霏等的研究結(jié)果一致。檸檬酸具有增色和護(hù)色作用,有利于花青素類(lèi)色素的穩(wěn)定性,且檸檬酸水溶液對(duì)pH的緩沖效果較好。因此本研究選擇使用0.1mol/L檸檬酸水溶液平衡樣品及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液的pH值。
3.3方法的檢出限、定量限及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
按照GB/T5009.1-2003的方法,測(cè)定11次樣品空白溶液的吸光值,計(jì)算檢出限及定量限。得出分光光度法檢測(cè)花青素的檢出限為0.188mg/100mL,定量限為0.625mg/100mL。葡萄酒樣品中花青素含量范圍約為1.2~8.1mg/100mL,方法定量限可以滿(mǎn)足檢測(cè)要求。圖3為花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),檢測(cè)波長(zhǎng)為518nm,標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性范圍為1~20μg/mL,線(xiàn)性較好,r2為0.9998,和毛建霏等研究結(jié)果一致。
3.4方法的加標(biāo)回收率
為了驗(yàn)證分光光度法的準(zhǔn)確性,本研究分析了花青素的加標(biāo)回收率。葡萄酒樣品中花青素含量為(6.58±0.38)mg/100mL,根據(jù)樣品中花青素的含量,選擇3個(gè)加標(biāo)水平做回收率實(shí)驗(yàn),加標(biāo)水平分別為4、8、12mg/100mL,表3為分光光度法花青素的加標(biāo)回收率。GB/T27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》中規(guī)定待測(cè)物質(zhì)含量為1~100mg/kg時(shí),加標(biāo)回收率范圍要求在90%~110%之間。分光光度法檢測(cè)葡萄酒中花青素的加標(biāo)回收率符合GB/T27404-2008的要求。
3.5矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的穩(wěn)定性分析
本研究分析了1周內(nèi)矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品母液的穩(wěn)定性。表4為儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度的影響。由表4可以看出,在標(biāo)準(zhǔn)品配制后的1d和2d與0d時(shí)比較,標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度大于99%,儲(chǔ)存時(shí)間為1d和2d時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品母液的穩(wěn)定性較高;儲(chǔ)存時(shí)間大于3d時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品吸光值發(fā)生顯著下降,儲(chǔ)存3d時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度降低至95.7%±0.1%,儲(chǔ)存6d時(shí)下降至93.2%±0.1%。由此可見(jiàn),標(biāo)準(zhǔn)品母液的儲(chǔ)存時(shí)間為2d,超過(guò)2d時(shí)標(biāo)準(zhǔn)品溶液將發(fā)生降解。
3.6分光光度計(jì)法與液相色譜法檢測(cè)花青素的結(jié)果對(duì)比
為了驗(yàn)證分光光度法測(cè)定花青素含量的準(zhǔn)確性,本研究同時(shí)使用液相色譜法分析葡萄酒樣品的花青素。葡萄酒中主要含有4種花青素:飛燕草色素、矢車(chē)菊色素、芍藥色素和錦葵色素。表5為葡萄酒樣品中4種花青素的含量,由表5可以看出,葡萄酒中飛燕草色素含量最高,其次是矢車(chē)菊色素。分光光度計(jì)法和液相色譜法測(cè)定樣品中花青素總量分別為(6.58±0.38)mg/100mL和(6.84±0.021)mg/100mL,兩者相對(duì)偏差為3.87%,由此可見(jiàn)分光光度法的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較好。
四、結(jié)論
本研究采用分光光度法分析葡萄酒中的花青素含量,葡萄酒樣品中花青素含量為(6.58±0.38)mg/100mL,該結(jié)果與液相色譜法檢測(cè)結(jié)果差異較小。分光光度法以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品,對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性進(jìn)行分析,確定了標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液最佳使用期限。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的最大吸收波長(zhǎng),將檢測(cè)波長(zhǎng)定為518nm。樣品檢測(cè)之前應(yīng)該先用經(jīng)亞硫酸鈉溶液處理過(guò)的樣品溶液調(diào)零,消除樣品中其他呈色物質(zhì)的影響。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品進(jìn)行稀釋時(shí),檸檬酸水溶液對(duì)pH的緩沖效果較好,可以使標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液的pH保持一致,不會(huì)因?yàn)閜H差異較大影響花青素吸光值。通過(guò)對(duì)回收率的分析得出,該方法的準(zhǔn)確性較好,花青素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性較好,且定量限可以滿(mǎn)足葡萄酒中花青素含量的檢測(cè)。分光光度法適合用于葡萄酒中花青素含量的檢測(cè)。
五、文獻(xiàn)出處及鳴謝
本文主要內(nèi)容部分出自：1.分光光度法檢測(cè)葡萄酒中花青素方法可行性分析
紀(jì)鵬飛1,張強(qiáng)2,宋俊男1,王希平1*,孫令超3,王芳1*
中圖分類(lèi)號(hào):DOI:10.19812/j.cnki.jfsq11-5956/ts.2020.23.068
感謝以上科研工作者的成果分享與交流！
