雙填料固相萃取-紫外分光光度法檢測茶湯中農(nóng)藥殘留

關(guān)鍵詞:溴氰菊酯，吡蟲啉，雙填料固相萃取，紫外分光光度計，茶湯；美析集團 www.macylab.com

  摘要:以沉淀聚合法制備溴氰菊酯和吡蟲啉分子印跡聚合物，然后干法裝柱制備雙填料固相萃取柱考察其吸附性能，利用紫外分光光度計確定溴氰菊酯和吡蟲啉的最大吸收波長，采用掃描電子顯微鏡對聚合物進行表征。實驗結(jié)果表明溴氰菊酯在220nm處吸收峰較大，而吡蟲啉在270nm處有最大吸收峰，且兩種聚合物均具有較好的吸附能力。溴氰菊酯和吡蟲啉在10～60mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(Ｒ2＞0.99)，當(dāng)以甲醇為活化溶劑、1mL/min的流速上樣、10%乙酸甲醇溶液作為洗脫劑時，該萃取柱對不同茶湯中溴氰菊酯和吡蟲啉的加標(biāo)回收率分別為83.15%～110.19%和80.61%～90.73%。對萃取柱8次重復(fù)利用結(jié)果證明該雙填料萃取柱具有較好的再生性，可應(yīng)用于茶葉中溴氰菊酯和吡蟲啉農(nóng)藥的定量檢測。

  隨著高毒有機磷農(nóng)藥相繼被禁用、淘汰甚至退出市場，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和煙堿類殺蟲劑憑借殺蟲譜廣、高效等優(yōu)點逐漸成為主要的替代品并廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域。但該類農(nóng)藥可通過皮膚吸附、口腔攝入等方式進入人體內(nèi)，對人體具有一定的致突變和致癌風(fēng)險。因此，開展農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留技術(shù)研究，可為保障農(nóng)產(chǎn)品安全等提供技術(shù)支持。目前，菊酯類和煙堿類農(nóng)藥的檢測方法主要有GC、LC－MS和GC－MS等儀器分析方法。然而由于此類農(nóng)藥通常以痕量形式存在于復(fù)雜樣品中，導(dǎo)致在進行多殘留檢測時存在萃取分離過程復(fù)雜，富集效果不好等問題。分子印跡固相萃取(MolecularlyImprintedSolidPhaseExtraction，MISPE)是將具有專一性、高度選擇性的分子印跡聚合物作為萃取填料，能夠選擇性濃縮痕量待測物，進而提高分離效率和分析準(zhǔn)確性，因此被廣泛應(yīng)用于食品、飼料中的抗生素及農(nóng)藥殘留分析。其中，Tang等以吡蟲啉印跡聚合物作為填料制備固相萃取柱，并成功地應(yīng)用于水和土壤中吡蟲啉的富集檢測;Martins等以溴氰菊酯分子印跡聚合物作為填料制得的分子印跡固相萃取柱實現(xiàn)了從橄欖油樣品中選擇性分離/預(yù)濃縮出溴氰菊酯。但目前相關(guān)農(nóng)殘檢測的研究大多數(shù)集中在制備單填料固相萃取柱來分離富集復(fù)雜樣品中的痕量目標(biāo)分析物，而通過制備雙填料固相萃取柱以實現(xiàn)兩種農(nóng)藥殘留同時檢測的研究未見報道。

  本研究以擬除蟲菊酯類和煙堿類農(nóng)藥中毒性強、應(yīng)用范圍廣的溴氰菊酯和吡蟲啉為模板分子分別制備溴氰菊酯分子印跡聚合物和吡蟲啉分子印跡聚合物，并以此兩種聚合物作為固相萃取材料，建立雙填料固相萃取柱以實現(xiàn)茶湯中溴氰菊酯和吡蟲啉農(nóng)藥的同時檢測，以期為采用雙填料分子印跡固相萃取技術(shù)去除檢測食品中農(nóng)藥殘留的研究提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支持。

一、材料和方法

1.1 材料與儀器

溴氰菊酯、(質(zhì)量分數(shù)＞98%);

吡蟲啉(純度95%);

綠茶、鐵觀音、英德紅茶(干茶葉);

紅茶飲料;

丙烯酸(acrylicacid，AA);

丙烯酰胺(acrylamide，AM)、

乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA);

偶氮二異丁腈(AIBN);

甲醇、冰乙酸、乙腈、丙酮、乙醇、二氯甲烷。

調(diào)速振蕩器;

磁力加熱攪拌器;

紫外-可見分光光度計;美析集團 www.macylab.com

隔膜真空泵;數(shù)顯恒溫水浴鍋;

掃描電子顯微鏡。

1.2  實驗方法

1.2.1 分子印跡聚合物的制備

1.2.1.1溴氰菊酯分子印跡聚合物的制備參照本課題組前期實驗成果，采用沉淀聚合法制備溴氰菊酯分子印跡聚合物。稱取1.010g溴氰菊酯、0.569gAM于錐形瓶中，再加入80mL乙腈溶解，置于磁力攪拌器上于28℃條件下低速攪拌1h，使模板分子與功能單體充分作用。然后加入7.920g交聯(lián)劑EGDMA和1.314g引發(fā)劑AIBN，繼續(xù)磁力攪拌10min，使超分子配合物與交聯(lián)劑和引發(fā)劑充分接觸，混合均勻，形成透明體系。并在功率為100Hz，溫度為10℃條件下超聲脫氣10min后將混合物轉(zhuǎn)移至三口燒瓶中，在60℃恒溫水浴鍋中機械攪拌反應(yīng)24h，攪拌速度控制在100～200r/min。

對所得聚合物進行抽濾，并用無水乙醇和蒸餾水各清洗2次，于65℃烘箱中干燥12h;以甲醇－乙酸溶液(體積比1∶1)作為洗脫溶劑，85℃恒溫抽提10h以除去模板分子，用甲醇洗去乙酸后再用蒸餾水反復(fù)清洗聚合物，最后將其置于65℃烘箱中干燥12h至質(zhì)量恒定，得到的白色粉末狀聚合物即為溴氰菊酯分子印跡聚合物(DMMIPs)。非印跡聚合物(non－imprintedpolymers，NIPs)的制備及處理方法同MIPs，但不加入模板分子。

1.2.1.2吡蟲啉分子印跡聚合物的制備參照本課題組前期實驗成果，采用懸浮聚合法制備吡蟲啉分子印跡聚合物。稱取0.511g吡蟲啉、0.576gAA加入裝有150mL甲醇的錐形瓶中，置于磁力攪拌器上于28℃條件下低速攪拌1h，使模板分子與功能單體充分作用。然后加入交聯(lián)劑9.910gEGDMA和0.050gAIBN，繼續(xù)攪拌10min，使超分子配合物與交聯(lián)劑和引發(fā)劑充分接觸。最后轉(zhuǎn)移到三口燒瓶中，在70℃恒溫水浴鍋內(nèi)反應(yīng)24h，攪拌速度控制在(100～200)r/min。對所得懸濁液進行抽濾，用無水乙醇和蒸餾水各清洗2次，70℃干燥12h使所得產(chǎn)物呈白色粉末狀，然后用丙酮溶液于65℃恒溫抽提8h以除去模板分子，再用蒸餾水反復(fù)清洗聚合物，最后將其置于70℃烘箱中烘干至恒重，得到的白色粉末狀物質(zhì)即為分子印跡聚合物(MIPs)。NIPs的制備及處理方法同MIPs，但不加入模板分子。

1.2.2確定最大吸收波長

分別配制濃度為10mg/L溴氰菊酯甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和吡蟲啉甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用紫外－可見分光光度計在400～190nm范圍內(nèi)進行全波長掃描。

1.2.3分子印跡聚合物的表征      

將溴氰菊酯分子印跡聚合物和吡蟲啉分子印跡聚合物進行噴金處理后，用掃描電子顯微鏡觀測其形貌特征。

1.2.4固相萃取分析

1.2.4.1溴氰菊酯吡蟲啉混合液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別稱取溴氰菊酯和吡蟲啉5、10、15、20、25、30mg的于100mL容量瓶中，加入乙腈定容并搖勻，作為工作液。用移液槍分別移取1mL工作液于一組10mL試管中，各加入乙腈定容并搖勻，即配得濃度為10～60mg/L的溴氰菊酯吡蟲啉混合溶液。用分光光度計在220、270nm波長處測定相應(yīng)濃度下溴氰菊酯、吡蟲啉的吸光度，平行測定3次，取平均值，并繪制吡蟲啉、溴氰菊酯混合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4.2雙填料固相萃取柱的制備

首先稱取0.100g溴氰菊酯MIPs作為填料，采用干法裝柱法將其填充入底部裝有篩板的聚丙烯外殼的固相萃取柱內(nèi)，然后取另一篩板置于溴氰菊酯MIPs上方;再稱取0.150g吡蟲啉MIPs作為第二層填料，采用同樣的方法填充入固相萃取柱中，裝好填料后，取同樣篩板置于柱體使其在填料上表面固定，即制得雙填料固相萃取柱。1.2.4.3茶湯的制備及紅茶飲料的處理稱取3.000g經(jīng)研磨后的干茶葉(紅茶、綠茶及鐵觀音)置于500mL錐形瓶中，加入沸蒸餾水450mL，沸水浴45min，每隔5min搖勻一次。浸提完畢后立即進行抽濾，待濾液冷卻至室溫后移至500mL容量瓶，加蒸餾水定容至刻度線即制得茶湯溶液。購于市場的紅茶飲料直接作為茶湯進行后續(xù)研究。

1.2.4.4不同茶湯中溴氰菊酯和吡蟲啉含量的測定

以建立的雙填料固相萃取技術(shù)對不同茶湯中溴氰菊酯和吡蟲啉含量進行檢測，固相萃取實驗之前，先用5mL甲醇溶液對分子印跡固相萃取柱采用直接淋洗的方式進行活化處理。取含有一定濃度溴氰菊酯吡蟲啉的茶湯溶液上固相萃取柱，用5mL正己烷溶液淋洗后，再取5mL10%乙酸甲醇進行特異性洗脫，流速均控制在1mL/min，收集洗脫液，用10mm比色杯，分別在波長220和270nm下用紫外分光光度計測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算洗脫液中溴氰菊酯和吡蟲啉的濃度。由下式計算固相萃取過程中溴氰菊酯和吡蟲啉的加標(biāo)回收率。

式中:Cs為平衡吸附后溶液中目標(biāo)物(Cs0)質(zhì)的濃度，mg/L;Cs0為目標(biāo)物質(zhì)的起始濃度，mg/L。

1.2.4.5雙填料MISPE再生性評價裝填一只新的固相萃取柱，安裝在固相萃取裝置上，采用1.2.4.4方法對萃取柱進行活化、上樣、淋洗和洗脫，萃取過程中流速均為1mL/min，收集洗脫液，吸干后再進行下次重復(fù)加樣萃取實驗，共重復(fù)8次。利用紫外分光光度計分別測定8次洗脫液中溴氰菊酯和吡蟲啉的吸光度，由1.2.4.4中公式計算固相萃取過程中溴氰菊酯和吡蟲啉的加標(biāo)回收率。

1.3   數(shù)據(jù)處理

所有實驗至少重復(fù)三次并采用平均值，采用

Origin8.5軟件進行作圖。

二、結(jié)果與分析

2.1 確定最大吸收波長

溴氰菊酯和吡蟲啉最大吸收波長測定結(jié)果如圖1(a)、圖1(b)所示。由圖1可知，溴氰菊酯在220nm處吸收峰較大，而吡蟲啉在270nm處有最大吸收峰。故分別選擇波長220和270nm測定溴氰菊酯和吡蟲啉的吸收值。

2.2分子印跡聚合物的表征

沉淀聚合所得溴氰菊酯和吡蟲啉分子印跡聚合物的掃描電鏡圖如圖2所示。由圖2(a)、(b)可知，所制備的溴氰菊酯MIPs和吡蟲啉MIPs均具有較規(guī)整的形貌，粒徑較小且分布相對均勻，微球結(jié)構(gòu)導(dǎo)致比表面積較大，使其具有較好的吸附能力。

2.3雙填料分子印跡固相萃取性能

2.3.1溴氰菊酯、吡蟲啉溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)1.2.4.1的方案配制溴氰菊酯吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)溶液，測其紫外吸收繪制吸光度－濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得溴氰菊酯溶液線性方程y=0.0417x+0.1077，Ｒ2=0.9972;吡蟲啉溶液線性方程y=0.041x+0.0514，Ｒ2=0.9981。溴氰菊酯、吡蟲啉溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖如圖3(a)、(b)所示。

2.3.2 固相萃取條件的優(yōu)化

本實驗以溴氰菊酯MIPs和吡蟲啉MIPs作為填料制備雙填料固相萃取柱，考察不同活化溶劑、洗脫溶劑、上樣濃度和流速對溴氰菊酯和吡蟲啉加標(biāo)回收率的影響。

2.3.2.1活化溶劑的選擇

對活化溶液進行優(yōu)化不僅可以保證固相萃取柱的保留性能，并且可以增強聚合物內(nèi)識別位點的活性。本實驗選用甲醇、50%甲醇水溶液和20%乙腈水溶液作為活化溶劑，考察不同活化溶劑對溴氰菊酯和吡蟲啉加標(biāo)回收率的影響。結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，當(dāng)甲醇作為活化溶劑時，溴氰菊酯和吡蟲啉的加標(biāo)回收率分別達到88%和82.04%，優(yōu)于其他兩種活化劑。這是因為分子印跡聚合物的有效印跡位點為聚合物于模板分子間形成的氫鍵，而自帶－OH的甲醇能夠有效的將印跡聚合物的有效印跡位點活化，達到對目標(biāo)分子選擇性吸收的目的，從而使目標(biāo)物質(zhì)盡可能的被填料吸附，故選擇聚合溶劑甲醇為活化劑進行后續(xù)試驗。

2.3.2.2洗脫溶劑的選擇

洗脫是通過干擾結(jié)合和強力溶解作用，破壞模板分子與印跡孔穴中結(jié)合位點的作用力，從而將目標(biāo)物洗脫解離的過程。本實驗選擇了乙腈、乙酸乙酯和10%乙酸－甲醇作為洗脫溶劑，考察MISPE對溴氰菊酯和吡蟲啉的加標(biāo)回收率影響。由圖5可知，在三種洗脫劑中，10%乙酸－甲醇作為洗脫溶劑時得到的溴氰菊酯和吡蟲啉加標(biāo)回收率較高，這是由于乙酸對甲醇起到極性修飾作用，乙酸的羧基同功能單體競爭性地與模板分子作用，破壞模板分子與印跡位點間的離子鍵及氫鍵作用，使目標(biāo)分析物從萃取材料表面較容易的洗脫下來。而乙酸乙酯和乙腈均屬于非質(zhì)子型溶劑，很難通過破壞聚合物與目標(biāo)分子之間的作用力將目標(biāo)分子有效快速地洗脫，因此洗脫效果相對較差。

故選用10%乙酸－甲醇作為洗脫溶劑。

2.3.2.3上樣濃度的選擇

為確定樣品濃度對雙填料MISPE吸附效果的影響，分別取濃度10、20、30、40、50mg/L的溴氰菊酯吡蟲啉溶液上樣，結(jié)果見圖6。由圖6可知，在上樣濃度10～50mg/L范圍內(nèi)，加標(biāo)回收率隨著上樣濃度的增加呈逐漸增大的趨勢，并在50mg/L時回收率達到最大，這是由于已吸附于聚合物上的模板分子對溶液中的目標(biāo)物質(zhì)的吸附起到表面堆積的協(xié)同作用。當(dāng)上樣濃度為30mg/L時，溴氰菊酯和吡蟲啉的加標(biāo)回收率均達到80%以上。根據(jù)農(nóng)殘檢測標(biāo)準(zhǔn)，加標(biāo)回收率達到80%以上即符合要求，故選擇30mg/L作為樣品上樣濃度。

2.3.2.4 柱流速的選擇

柱流速會影響目標(biāo)物與MISPE的接觸時間，從而影響目標(biāo)物的結(jié)合率。本實驗考察MISPE在流速分別為1、3、5mL/min時對溴氰菊酯和吡蟲啉的結(jié)合性能，如圖7所示。結(jié)果表明，MISPE對溴氰菊酯和吡蟲啉的加標(biāo)回收率隨著柱流速的增大而逐漸降低。這是因為在低流速條件下，目標(biāo)物質(zhì)可與填料充分作用，結(jié)合率較高;而流速過快，待測物尚未與吸附劑相互作用就被溶劑帶出，導(dǎo)致回收率降低，故選擇流速為1mL/min。

2.3.3茶湯及紅茶飲料中溴氰菊酯和吡蟲啉含量的檢測

根據(jù)1.2.4.3所述方法制備茶湯，通過本實驗建立的雙填料固相萃?。贤夥止夤舛确z測紅茶、綠茶、鐵觀音和紅茶飲料的茶湯中溴氰菊酯和吡蟲啉含量。根據(jù)1.2.4.4方法探究雙填料分子印跡固相萃取對不同茶湯中溴氰菊酯和吡蟲啉的吸附性。由圖8可知，所制得的雙填料固相萃取柱對茶湯中兩種加標(biāo)農(nóng)藥均具有較好的回收率，其中對溴氰菊酯的加標(biāo)回收率為83.15%～110.19%，這與樊瑋等利用單填料萃取柱檢測茶葉中溴氰菊酯的回收率(90.5%～102%)相差不大;對吡蟲啉的加標(biāo)回收率為80.61%～90.73%，雖然與本課題組前期僅利用吡蟲啉分子印跡聚合物作為填料制備固相萃取柱測得的茶湯中吡蟲啉回收率(97.2%～98.4%)相比稍低，但能實現(xiàn)兩個組分的同時檢測，符合農(nóng)藥殘留檢測要求。說明本研究所制備的雙填料固相萃取柱對不同茶湯中的模板分子均具有較好的專一性和特異吸附性，能用于不同種類茶湯等復(fù)雜基質(zhì)中痕量成分的富集提純。

2.4雙填料MISPE再生性評價

選取濃度為30mg/L的上樣溶液對雙填料固相萃取柱進行上樣，按照最佳條件吸附、洗脫，回收率與萃取柱使用次數(shù)的關(guān)系見圖9。由圖9可知，對雙填料MISPE進行第一次樣品萃取和洗脫處理后，溴氰菊酯和吡蟲啉的回收率分別為88%和82.04%，重復(fù)使用8次后，溴氰菊酯和吡蟲啉的回收率稍有下降至85.98%、80.45%，但均符合農(nóng)殘檢測標(biāo)準(zhǔn)。說明該方法制備的雙填料分子印跡固相萃取柱具有良好的穩(wěn)定性和再生性。

三、結(jié)論

本文以優(yōu)化合成的溴氰菊酯分子印跡聚合物和吡蟲啉分子印跡聚合物作為吸附劑制備雙填料固相萃取柱，通過動態(tài)吸附實驗確定最佳固相萃取條件為:流速1mL/min，甲醇為活化溶劑，10%的乙酸甲醇溶液為洗脫溶劑，上樣濃度為30mg/L。在最優(yōu)的萃取條件下，制備的材料對不同茶湯中的溴氰菊酯和吡蟲啉均具有較好的富集萃取效果。經(jīng)過8次循環(huán)實驗后溴氰菊酯吡蟲啉的回收率并沒有明顯下降，說明該固相萃取柱的重復(fù)再生性好。相對于傳統(tǒng)的單填料萃取柱，制備的雙填料固相萃取柱能實現(xiàn)兩個組分的同時檢測且符合農(nóng)殘檢測要求，有望作為茶葉等復(fù)雜基質(zhì)分析檢測前的富集提純材料，為采用雙填料分子印跡固相萃取技術(shù)探索食品中農(nóng)藥殘留的分析提供了一種新思路。

四、文獻出處及鳴謝
本文主要內(nèi)容部分出自：1.雙填料固相萃取-紫外分光光度法檢測茶湯中農(nóng)藥殘留；謝雷，吳婉儀，李璐*，解新安，李雁