紫外分光光度計法測定載藥納米纖維氈的藥物釋放性能

紫外分光光度計法測定載藥納米纖維氈的藥物釋放性能

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在中國、美國、英國、日本等不少國家，藥物釋放度檢查實際是指藥物固體制劑按照各國藥典規(guī)定的方法，在一定時間內從固體制劑溶入介質的累計百分率（以被測試劑標示量計算）。釋放度是評價藥物制劑的質量、固體制劑的生物利用度以及篩選固體制劑工藝、處方和劑型的重要手段[1-2]。藥物釋放度是隨著科學技術和生物藥劑學的發(fā)展而迅速發(fā)展起來的一種新的藥品檢驗方法?，F有的釋放度測定方法基本上是針對緩釋制劑、控釋制劑、腸溶制劑及透皮貼劑等藥物制劑提出，對目前重點研究的有關載藥纖維氈的溶出度測定尚無明確的表述。 

　　載藥纖維氈中藥物含量相對于藥物制劑中載體藥物的含量低，對測試所用儀器精度要求較高；載藥纖維氈容易漂浮在緩沖溶液中不易浸潤，從而難以保證藥物有效釋放；藥物體外釋放時需要模擬人體的真實環(huán)境（即漏槽條件的確定），一系列的問題導致了現有的試驗裝置難以較真實地模擬載藥纖維氈的藥物釋放行為。 

　　本研究選擇美國食品和藥品管理局（FDA）已批準可應用的乳酸（lactic acid）和羥基乙酸（glycolic acid）共聚物[Poly（L-lactide-co-glycolide），PLGA]為原料通過靜電紡絲制備納米纖維氈作為研究對象，以水溶性鹽酸四環(huán)素（tetracycline hydrochloride，Tet）為模擬藥物，詳細研究了采用紫外分光光度計法測試和評價PLGA載藥納米纖維在模擬腸液中的體外藥物釋放行為。 

　　1 試驗部分 

　　1.1 試驗原料和測試儀器 

　　聚乳酸-羥基乙酸/鹽酸四環(huán)素（PLGA/Tet）靜電紡絲纖維氈由實驗室自行制備，三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、濃鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉等均為分析純。 

　　所采用的測試設備如下：臺式離心機、曲線控制真空干燥箱、電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9140A）、集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S、取液器、電子天平、精密pH計、紫外可見分光光度計、恒溫振蕩器。 

　　1.2 試驗方法與步驟 

　　1.2.1 人工模擬腸液的配制 

　　根據2010年版《中國藥典》（二部）附錄Ⅳ中D緩沖液的配制方法，配制pH=6.8的磷酸緩沖溶液[以下簡稱為PBS（pH=6.8）緩沖溶液]作為本試驗體外釋放的介質。 

　　1.2.2 紫外分光光度計測定波長和最小分辨率的確定 

　　利用紫外可見分光光度計測量藥物的含量[3， 6， 11-15]，這一方法的可操作性、靈敏性和重復性是需要考慮的重要因素，吸收波長和最小分辨率的確定直接決定著測試數據的有效性。 

　?。?） 標準曲線的繪制 

　　稱取一定量的Tet，置于50mL容量瓶中，用PBS溶液適量振蕩使其完全溶解，加PBS溶液溶解并稀釋至刻度，作為貯備液。分別從貯備液中量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL置于10mL的容量瓶中，用PBS溶液稀釋至刻度，搖勻，得到系列標準溶液。按照分光光度法[2010年版《中國藥典》（二部）附錄Ⅳ]，選取360nm為工作波長測定吸光度[9， 16]，以吸光度（A，Abs）對濃度（C，μg/mL）作線性回歸，繪制標準曲線y=0.034x+0.002（R2=0.999）。結果表明，Tet在1μg/mL～70μg/mL范圍內濃度和吸收度呈良好的線性相關性。 

　　由此表明，在所測質量濃度范圍內，溶液的吸光度與質量濃度呈良好的線性關系，具有較高的置信度。 

　?。?） 最小分辨率的確定 

　　由于紫外可見分光光度計儀器的最小分辨率為0.001Abs，最大吸光度為3.000Abs，儀器的讀數偏差在±0.004Abs的范圍內，根據Tet在PBS緩沖溶液中的標準工作曲線換算得知，儀器對藥物存在一個最小分辨率和最佳測試范圍的問題，本試驗中儀器對Tet的測試范圍為0.03μg/mL ～88.24μg/mL。但是由于吸光度和濃度在一定的范圍內呈現線性關系，當藥物含量低于儀器的最小分辨率時，采用紫外分光光度法測試藥物的溶解度存在較大的誤差。此時，可以選用其他精確度更高的測試方法，比如高效液相色譜法等[4， 17-18]。而當藥物濃度太高時，吸光度與濃度的關系就偏離了線性范圍。所以，紫外可見分光光度計測試藥物的釋放度存在一個最佳測試范圍。本試驗中，Tet對PBS緩沖溶液的最佳測試范圍為1μg/mL～70μg/mL。 

　　1.2.3 纖維氈載藥量的測定 

　　本試驗條件是模擬人體腸液的環(huán)境，故選用人體的溫度（37±0.5）℃為溶出介質溫度。 

　　采用萃取法測定納米纖維的載藥量。取待測纖維膜10mg，溶解在5mL的三氯甲烷中，加入10mL的PBS溶液，超聲振蕩，以30min為時間間隔，不同時間取上層清液，高速離心機5000rpm的速度離心6 min后，用紫外分光光度計檢測溶液的吸光度。當吸光度不再改變，表示藥物已經完全從溶解的三氯甲烷中溶解萃取出來。通過對比標準曲線獲得藥物的濃度，再通過換算得到纖維膜的載藥量。 　

1.2.4 纖維氈藥物體外釋放度的測定 

　　方法一：取待測纖維膜10mg，浸入含5mL PBS緩沖溶液的具塞試管中，并將具塞試管放入恒溫振蕩器中（37℃，120r/min）恒溫振蕩，于一定時間分別取出納米纖維膜，同時加入5mL恒溫后的相應新鮮緩沖液。按照分光光度法[2010年版《中國藥典》（二部）附錄Ⅳ]檢測待測溶液的吸光度，根據標準曲線求得各取樣時間釋放液中的藥物濃度，計算各取樣時間的累計釋放量，累積釋放量與實際藥物含量的比值，即為各取樣時間藥物的累計釋放百分率。藥物累計濃度的計算公式為 

　　方法二：體外釋放測定之前，先確定藥物于37℃時在PBS中的溶解度。稱取過量的鹽酸四環(huán)素藥物于一定量的PBS溶液中，在（37±0.5）℃的恒溫水浴中攪拌2h待充分溶解，靜置24h，取上層清液離心（5000rpm，2min），加入PBS緩沖溶液稀釋搖勻后于最大吸收波長處測試溶液的吸光度，根據標準曲線計算其飽和溶解度。 

　　根據溶解度計算出溶解實際載藥量的藥物所需的介質體積。本試驗中，為了與方法一對比，我們固定釋放介質體積為10mL，按照漏槽條件反推換算成所需的納米纖維氈質量（如5%Tet/PLGA/PBS，稱取15mg纖維膜；8%Tet/PLGA/PBS，稱取10mg纖維膜），浸入含10mLPBS緩沖溶液的25mL錐形瓶中，然后將錐形瓶放入恒溫振蕩器中（37℃，120rpm），一定時間分別用取液器吸取1mL溶液備測，同時加入1mL恒溫后的相應新鮮緩沖液。檢測待測溶液的吸光度，根據標準曲線求得各取樣時間釋放液中的藥物濃度，計算各時間的累計釋放量，除以實際藥物含量，即得各取樣時間藥物的累計釋放率。另外需要對藥物濃度校正，校正公式為： 

　　上述所有測試，對每一個樣品進行3次平行測定。 

　　2 結果與討論 

　　2.1 紫外分光光度計法的可行性分析 

　　為了研究紫外分光光度計法的準確性和可行性，我們對同一個載藥纖維膜在三處不同的部位取樣，利用紫外可見分光光度計測量藥物釋放度，結果如圖1。 

　　從圖1可以看出，對同一個納米纖維氈樣品，利用紫外分光光度計3次測量得出的釋放曲線整體趨勢相似，都是先突釋、后緩釋，曲線拐點都出現在8h的取樣點處。累計釋放率存在的偏差，原因主要在于所紡納米纖維氈各處藥物分布并不能達到完全一致，不同取樣部位載藥量會有一定的差別，但是偏差都在4%以內。另外，當藥物釋放一定時間之后，釋藥曲線會出現一定程度下降。這可能是因為采用方法二中的公式計算累計釋放率時，當某兩個取樣時間點內藥物釋放量較小時，釋放介質整體的濃度變化較小，從而實際吸光度變化也很小。本試驗中所用紫外分光光度計讀數偏差在±0.004的范圍內。將這一微小的偏差根據標準工作曲線反推得到的濃度也會有一定的偏差，從而使得累計釋放率出現下降的趨勢。同時，藥物釋放的后期，纖維膜表面由于藥物釋放溶解后形成的納米微孔，導致纖維氈有一定的降解和藥物的反吸附。故當藥物濃度低于儀器的測量精確度時，為了得到更加準確的結果，可以考慮精確度更高的測試方法，比如高效液相色譜法等。 

　　對于同一樣品，不同測試日期，測試載藥纖維氈藥物釋放性能，其結果如圖2所示。由圖可見，不同測試日期，載藥纖維氈表現出一致的藥物釋放趨勢。這些結果充分說明本試驗采用紫外分光光度計法的可行性。 

　　2.2 漏槽條件對纖維氈緩釋性能的影響 

　　釋放介質的體積應符合漏槽條件。漏槽狀態(tài)即藥物所處釋放介質的濃度遠小于其飽和濃度。漏槽狀態(tài)的生理學解釋為：藥物在體內被迅速吸收，制劑的體外包括釋放度等測定需要模仿體內生理條件的，滿足藥物溶解—吸收的過程。漏槽條件起到了修正作用，一般釋放介質的體積為藥物飽和溶液所需介質體積的3～7倍。因此需要釋藥系統(tǒng)在體內處于這樣的狀態(tài)。根據漏槽條件和藥物溶解度，調整不同藥物含量纖維膜的質量和釋放介質的體積，使得實際藥物體外釋放體系更接近體內生理條件。 

　　本文建立了兩種釋放度測定方法，方法一未考慮漏槽條件來選擇釋放介質的體積，只保證藥物可完全溶解。方法二嚴格按照漏槽條件要求確定釋放介質體積。兩種方法所測得藥物釋放率如圖3所示。從圖可以看出，同一時刻，方法二藥物的釋放率比方法一高達20%。這是因為方法二中釋放介質體積遠大于藥物完全溶解所需的體積。藥物從纖維膜上擴散到介質中的速率受濃度梯度和藥物溶蝕的影響，釋放介質越多，濃度梯度越大，藥物的遷移速度越快，釋放率越高。當藥物在人體內釋放時，人體內的腸液或組織液都不是靜止狀態(tài)，會及時帶走釋放出來的藥物。這就相當于介質體積很大，也即漏槽條件是模擬人體內釋放環(huán)境的一個必要因素。 

　　方法一中，把纖維膜全部取出，藥物和緩沖溶液在纖維膜上的殘留和損失、量取新鮮溶液的體積誤差、纖維膜的鋪展程度、操作時間誤差及藥物在溶液中的溶解度都會影響方法一測試結果的準確性。更重要的是，方法一未考慮藥物在體外釋放體系的溶解度和漏槽條件，不能更好地模擬人體體外釋放的真實條件。調整后的測試藥物釋放方法（方法二）比之前把纖維膜取出、完全更換緩沖液的方法（方法一）更接近藥物體外釋放的情況，特別對于纖維膜容易降解（逐漸轉變?yōu)樗槠屠w維膜在緩沖溶液中逐漸腐爛）的情況，方法二更準確。