紫外分光光度法測定蛋白質含量

關鍵詞：蛋白質；紫外分光光度法；美析儀器www.macylab.com；UV-1700PC

一、實驗目的 

?1、 學習紫外分光光度法測定蛋白質含量的原理; 

?2、 掌握紫外分光光度法測定蛋白質含量的實驗技術;  

?3、 掌握UV-1700PC紫外-可見分光光度計的使用方法并了解此儀器的主要構造。 

二、實驗原理 

紫外-可見吸收光譜法又稱紫外-可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波長范圍內的吸收光譜，是以溶液中物質分子對光的選擇性吸收為基礎而建立起來的一類分析方法。紫外-可見吸收光譜的產生是由于分子的外層價電子躍遷的結果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。 

進行定性:利用紫外-可見吸收光譜法進行定性分析一般采用光譜比較法。即將未知純化合物的吸收光譜特征，如吸收峰的數(shù)目、位置、相對強度以及吸收峰的形狀與已知純化合物的吸收光譜進行比較。      

定量分析: 紫外-可見吸收光譜法進行定量分析的依據是朗伯-比爾定律：A=lgI0/I=εbc，當入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內，有色物質的吸光度A與該物質的濃度c成正比，即物質在一定波長處的吸光度與它的濃度成線形關系。因此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度，就可求出溶液中物質濃度和含量。由于最大吸收波長λmax處的摩爾吸收系數(shù)最大，通常都是測量λmax的吸光度，以獲得最大靈敏度。 

光度分析時，分別將空白溶液和待測溶液裝入厚度為b的兩個吸收池中，讓一束一定波長的平行單色光非別照射空白和待測溶液，以通過空白溶液的透光強度為I0，通過待測溶液的透光強度為I，根據上式，由儀器直接給出I0與I之比的對數(shù)值即吸光度。 

紫外-可見分光光度計:紫外-可見吸收光譜法所采用的儀器稱為分光光度計，它的主要部件有五個部分組成，即 

由光源發(fā)出的復合光經過單色器分光后即可獲得任一所需波長的平行單色光,該單色光通過樣品池靜樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測器上產生光電流，產生的光電流由信號顯示器直接讀出吸光度A。可見光區(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池;紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。

本實驗采用紫外分光光度法測定蛋白質含量的實驗原理：

（1）蛋白質可作定量分析的原因：蛋白質中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質溶液在275 280nm具有一個吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內，蛋白質溶液在最大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比，服從朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。該法測定蛋白質的濃度范圍為0.1—1.0mg/mL。

（2）此種方法測量的準確度差一點的原因：由于不同蛋白質中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白質溶液在280nm的光吸收職也不同。據初步統(tǒng)計，濃度為1.0 mg/mL的1800種蛋白質及蛋白質亞基在280nm的吸光度在0.3—3.0之間，平均值為1.25+/-0.51。所以此種方法測量的準確度差一點。

（3）有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時的經驗公式：若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質，在280nm處來測量蛋白質含量時，會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強，但蛋白質卻恰恰相反，因此可利用280nm及260nm的吸收差來計算蛋白質的含量。常用下列經驗公式計算：

蛋白質濃度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260

(A280和A260分別為蛋白質溶液在280nm和260nm處測得的吸光度值)

還可以通過下述經驗公式直接計算出溶液中的蛋白質的含量：

蛋白質濃度（mg/mL）=F* A280*D*1/d

其中A280為蛋白質溶液在280nm處測得的吸光度值；d為石英比色皿的厚度（cm）;D為溶液的稀釋倍數(shù)；F為校正因子

（4）稀溶液中蛋白質濃度測定的經驗公式：蛋白質的肽鍵在200—250nm有強的紫外吸收。其光吸收強度在一定范圍與濃度成正比，其波長越短，光吸收越強。若選用215nm可減少干擾及光散射，用215nm和225nm光吸收差值與單一波長測定相比，可減少非蛋白質成分引起的誤差，因此，對稀溶液中蛋白質濃度測定，可選用215nm和225nm光吸收差法。常用下列經驗公式：

蛋白質濃度（mg/mL）=0.144（A215-A225）

（A215和A225分別為蛋白質溶液在215nm和225nm處測得的吸光度值）

三、儀器與試劑

儀器：UV-1700PC紫外-可見分光光度計，比色管（10ml的5個），吸量管。

試劑：標準蛋白質溶液：3.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液，待測蛋白質溶液。

四、實驗步驟 

〈一〉   準備工作 

1．啟動計算機，打開主機電源開關，啟動工作站并初始化儀器。    

2. 在工作界面上選擇測量項目（光譜掃描，光度測量），本實驗選擇光度測量，設置測量條件（測量波長等）。 

3. 將空白放入測量池中，點擊START掃描空白，點擊ZERO校零。 

4. 標準曲線的制作。  

〈二〉測量工作  

1.吸收曲線的繪制:用吸量管吸取2mL3.00mg/mL標準蛋白質溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl

溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm～400nm區(qū)間，測量吸光度。   

2.標準曲線的制作：用吸量管分別吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL 3.00 mg.mL^-1標準蛋白質溶液于5只10 mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標準溶液的吸光度A278 記錄所得讀數(shù)。

 3.樣品測定：取適量濃度的待測蛋白質溶液3 mL，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻，按上述方法測定278nm處的吸光度。平行測定三份。

五、數(shù)據處理： 

1.以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制吸收曲線，找出最大吸收波長。

由吸收曲線可得最大吸收波長λmax=278nm

2.以標準蛋白質溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

待測蛋白質的吸光度

平均濃度=0.641088  mg/mL

SD= 0.009434

RSD= 1.4715%

當置信度為P=95%時,f=2,t0.95,2=4.3

在誤差允許的范圍內，蛋白質的含量為0.641088mg/mL

六、思考題

紫外分光光度法測定蛋白質含量的方法有何優(yōu)缺點？受哪些因素的影響和限制？

答：優(yōu)點：方法操作簡便、迅速、不需要復雜和昂貴的設備，不消耗樣品，測定后仍能回收利用，低濃度的鹽和大多數(shù)緩沖溶液不干擾測定。

缺點：準確度和靈敏度差一點。干擾物質多；對于測定那些與標準蛋白質中鉻氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質，有一定的誤差。若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物質，會產生較大干擾。

干擾因素：主要受溶劑的影響。

七，實驗總結與反思。

相比于上一個鄰二氮菲分光光度法測定微量鐵的實驗來說，這個實驗的操作步驟是相當?shù)暮唵危鲥e的幾率也小。最后測出樣品的吸光度要比另一組的大的原因，我想可能是標準蛋白質溶液的問題，我們兩個小組用的不是一個容量瓶中的標準蛋白質溶液，他們組使用的是新配置的，我們小組使用的是之前遺留下來的，而且只剩下一點點，但是足夠我們做這次實驗的量，我想很有可能是蛋白質沉積在了底部，每次使用前沒有輕輕的混合均勻，導致底部濃度偏大，最后就影響到了我們待測溶液的濃度的測定。

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