紫外分光光度法粗多糖的測(cè)定
發(fā)布日期：2017-09-26 點(diǎn)擊次數(shù)：
關(guān)鍵詞：紫外分光光度法；枸杞多糖；靈芝多糖；；美析儀器www.macylab.com；UV-1100;UV-1200
應(yīng)用硫酸-苯酚比色法測(cè)食品中的粗多糖的含量而且分別用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)品和用葡聚糖做標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果表明前者測(cè)的結(jié)果稍偏高,大約高于4.8﹪。此方法簡(jiǎn)便快捷,正確度高,重現(xiàn)性好,可適用于各種粗多糖的測(cè)定。
由十個(gè)以上單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的碳水化合物稱為“多糖”。它一般都是自然高分子化合物。多糖包括活性多糖和膳食纖維兩大類?；钚远嗵菍Ｖ妇哂心撤N特殊生物活性的多糖化合物，如真菌多糖、植物多糖和殼聚糖等。這些多糖具有復(fù)雜的、多方面的生理活性和功能，如：免疫調(diào)節(jié)功能；抗腫瘤作用；延緩朽邁作用；降血脂、抗血栓作用等功能[1-2]，因而越來(lái)越引起人們的關(guān)注。
多糖的測(cè)定方法目前還沒(méi)有國(guó)家規(guī)定的方法,文獻(xiàn)報(bào)道的方法基本上是苯酚-硫酸法和蒽酮-硫酸法，在作標(biāo)準(zhǔn)曲線大部分都是用葡萄糖來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)品，而不是用葡聚糖（MW500，000），由于葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品在國(guó)內(nèi)難于獲得且價(jià)格昂貴。但是根據(jù)國(guó)內(nèi)外大量研究資料表明：香菇、金針菇、云芝、冬草、夏草、靈芝、茯苓、豬苓中所含的具有增強(qiáng)免疫、抑制腫瘤、鎮(zhèn)靜、強(qiáng)心、消炎等生理活性的水溶性多糖均由β(1—3)或β(1—6)糖苷鍵連接葡聚糖構(gòu)成主鏈和支鏈，有的甚至就是β-葡聚糖，那么用葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)品和用葡聚糖作標(biāo)準(zhǔn)品往測(cè)食品中的多糖含量時(shí)是否有差別且差別為多少，本文以枸杞多糖和靈芝多糖來(lái)進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)。
1.材料與方法
1.1供試材料
枸杞多糖 (多糖含量在40-60﹪,其含量由國(guó)家檢測(cè)部分檢測(cè))；
靈芝多糖 (多糖含量在40-60﹪,其含量由國(guó)家檢測(cè)部分檢測(cè))；
葡聚糖（MW500，000）
1.2試劑
（1）銅儲(chǔ)備液：
稱取0.3gCuSO45H2O,3g檸檬酸鈉，加水溶解并稀釋至100ml，混勻，備用。
（2）銅試劑溶液：
取銅儲(chǔ)備液50ml，加水50ml，混勻后加進(jìn)固體無(wú)水硫酸鈉12.5g并使其溶解。臨用新配。
（3）洗滌劑：
取水50ml,加進(jìn)10ml銅試劑溶液，10ml氫氧化鈉溶液，混勻。
（4）乙醇溶液(80﹪)：20ml水中加進(jìn)無(wú)水乙醇80ml，混勻。
（5）氫氧化鈉溶液(10﹪)：
稱取lOg氫氧化鈉，加水溶解并稀釋至100ml，加進(jìn)固體無(wú)水硫酸鈉至飽和，備用。
（6）硫酸溶液：
取10ml濃硫酸加進(jìn)到80ml左右水中，混勻，冷卻后稀釋至100ml。
（7）苯酚溶液（5﹪）：
取苯酚100g，油浴蒸餾，收集180℃-182℃餾分。稱取精制苯酚5.0g，加進(jìn)溶解并稀釋至100ml，混勻，溶液置冰箱中可保存一個(gè)月。
（8）葡萄糖/葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：
精密稱取在1050C于燥至恒重的葡萄糖/葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品1.0080g，加水溶解，并定容至100ml，混勻，置冰箱中保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖/葡聚糖。
（9）葡萄糖/葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：
吸取葡萄糖/葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液2.00ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。
1.3儀器
美析紫外分光光度計(jì)UV-1100;UV-1200
離心機(jī)
旋轉(zhuǎn)混勻器
1.4實(shí)驗(yàn)方法
1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相當(dāng)于葡萄糖0，0.04032，0.08064，0.12096，0.16128，0.2016mg）分別置于25ml比色管中，正確補(bǔ)充水至2.0ml，加進(jìn)苯酚溶液2.0ml，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加進(jìn)濃硫酸10ml，于旋轉(zhuǎn)混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光光度計(jì)在490nm波優(yōu)點(diǎn)以試劑空缺溶液為參比，1cm比色皿測(cè)定吸光度值。具體結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)與濃度的關(guān)系
__________________________________________________________________
標(biāo)準(zhǔn)液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
濃度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
吸光度(A) 0 0.166 0.343 0.514 0.690 0.882
___________________________________________________________________
以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。
圖1 標(biāo)準(zhǔn)回回曲線方程圖
其回回方程Y=4.4122X-0.0147,相關(guān)系數(shù)r=0.9996。
1.4.2 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備
精密吸取葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，（相當(dāng)于葡聚糖0，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10mg）分別置于25ml比色管中，正確補(bǔ)充水至2.0ml，加進(jìn)苯酚溶液2.0ml，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加進(jìn)濃硫酸10ml，于旋轉(zhuǎn)混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光光度計(jì)在485nm波優(yōu)點(diǎn)以試劑空缺溶液為參比，1cm比色皿測(cè)定吸光度值。具體結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)與濃度的關(guān)系
______________________________________________________________________
標(biāo)準(zhǔn)液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
濃度(mg/ml) 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1
吸光度(A) 0 0.083 0.171 0.256 0.352 0.456
__________________________________________________________________
以葡聚糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖2)。
圖2 標(biāo)準(zhǔn)回回曲線方程圖
其回回方程Y=4.635X-0.0145,相關(guān)系數(shù)r=0.9983。
1.5樣品的測(cè)定
1.5.1樣品提取
稱取混合均勻的含粗多糖樣品(M)2.0g,置于100ml(V1)容量瓶中,加水80ml左右,于沸水浴上加熱2h,冷卻至室溫后補(bǔ)加水至刻度,混勻,過(guò)濾,濾液供沉淀多糖。
1.5.2沉淀粗多糖
精密取1.5.1項(xiàng)下濾液4.0ml(V2)(作四組平行實(shí)驗(yàn))或液體樣品(V2)4.0ml(即被測(cè)多糖就是液體而不是固體樣品)置于50ml離心管中,加進(jìn)無(wú)水乙醇16ml,混勻后,以4000rpm離心15min,棄往上清液。沉淀用乙醇溶液數(shù)毫升洗滌,離心后棄往上清液,反復(fù)3-4次操縱。接下來(lái)沉淀用水溶解并定容至5.0ml(V3),混勻后,供沉淀葡聚糖。
1.5.3沉淀葡聚糖
精密取1.5.2項(xiàng)溶液2ml(V4)置于20ml離心管中,加進(jìn)NaOH溶液2.0ml,銅試劑溶液2.0ml,沸水浴中煮沸3min,冷卻后以4000rpm離心15min,棄往上清液。沉淀用洗滌劑數(shù)毫升洗滌,離心后棄往上清液,反復(fù)3次操縱后,沉淀用硫酸溶液2.0ml溶解并轉(zhuǎn)移至50ml(V5)容量瓶中，加水淡薄至刻度，混勻。此溶液為樣品測(cè)定液。
1.5.4 測(cè)定
精密取1.5.3項(xiàng)的樣品測(cè)定液2.0ml(V6)置于25ml比色管中，加進(jìn)苯酚溶液2.0ml,在旋轉(zhuǎn)混合器上混勻后,小心加進(jìn)濃硫酸10.0ml后于旋轉(zhuǎn)混合器上混勻后,置于水浴中煮沸10min,冷卻至室溫用分光光度計(jì)在490nm波優(yōu)點(diǎn),以試劑空缺為參比,1cm比色皿測(cè)定吸光度值，同時(shí)做樣品空缺實(shí)驗(yàn)。從葡萄糖/葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出葡萄糖/葡聚糖質(zhì)量,再計(jì)算樣品中粗多糖含量(見(jiàn)表3)。
表3.以葡萄糖計(jì)和以葡聚糖計(jì)來(lái)確定粗多糖含量
_________________________________________________________________________________
編號(hào) 吸光度 樣品中枸杞多糖含量(mg/g) 樣品中靈芝多糖含量(mg/g)
______________ ________________________ _____________________
枸杞多糖 靈芝多糖 以葡萄糖計(jì) 以葡聚糖計(jì) 以葡萄糖計(jì) 以葡聚糖計(jì)
1 0.150 0.146 0.453 0.431 0.423 0.403
2 0.145 0.148 0.440 0.417 0.429 0.408
3 0.139 0.142 0.423 0.402 0.413 0.394
4 0.150 0.151 0.453 0.431 0.437 0.416
___________________________________________________________________________________
2.計(jì)算公式
X=(W1-W2)×V1×W3×W5/M×V2×V4×V6
式中: X-----樣品中粗多糖含量(以葡萄糖/葡聚糖計(jì)),mg/g
W1----樣品測(cè)定液中葡萄糖/葡聚糖質(zhì)量,mg
W2--- 樣品空缺液中葡萄糖/葡聚糖質(zhì)量,mg
M----樣品質(zhì)量，g
V1----樣品提取液總體積,ml
V2---沉淀粗多糖所用樣品提取液體積,ml
V3----粗多糖溶液體積,ml
V4---沉淀葡聚糖所用粗多糖溶液體積,ml
V5---樣品測(cè)定液總體積,ml
V6---測(cè)定用樣品測(cè)定溶液體積，ml
3.穩(wěn)定性試驗(yàn)
樣品顯色后,每隔一定時(shí)間測(cè)定吸光度,結(jié)果見(jiàn)表4。
表4 吸光度穩(wěn)定性試驗(yàn)
________________________________________________________________________________
時(shí)間 10min 20min 30min 1h 1.5h 2h
A 0.150 0.151 0.148 0.151 0.150 0.147
____________________________________________________________________________________
結(jié)果表明，該顯色反應(yīng)穩(wěn)定。
4．回收率測(cè)定（采用加樣回收法）
吸取多糖樣品溶液0.5ml，分別加進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0，0.2,0.4,0.6,0.8,1.0ml，分別置于25ml試管中，各加水1ml,加進(jìn)苯酚溶液2ml，緩緩加濃硫酸10ml于旋轉(zhuǎn)混勻器小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光光度計(jì)在485nm波優(yōu)點(diǎn)以試劑空缺溶液為參比，1cm比色皿測(cè)定吸光度值。結(jié)果顯示回收率是93.15-99.7﹪。
5.小結(jié)
(1)由表3可知,用葡萄糖來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)品和用葡聚糖做標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)食品中的粗多糖含量時(shí),前者測(cè)的結(jié)果稍偏高,大約高4.8﹪,但葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的價(jià)格昂貴且在國(guó)內(nèi)難于買(mǎi)到,故可以用葡萄糖來(lái)代替葡聚糖做標(biāo)準(zhǔn)品。
(2)食品中分子量>10000的高分子物質(zhì)在80﹪乙醇溶液中沉淀，與水溶性單糖和低聚糖分離，用堿性二價(jià)銅試劑選擇性的從其它高分子物質(zhì)中沉淀具有葡聚糖結(jié)構(gòu)的多糖，粗多糖在硫酸的作用下，水解成單糖，并迅速脫水天生糖醛衍生物，與苯酚縮合成有色化合物，用分光光度法測(cè)定樣品在粗多糖含量。
(3)此方法可很好的用于食品中粗多糖含量的測(cè)定，由于不需要對(duì)多糖進(jìn)行純化和脫色處理。
(4)洗滌粗多糖沉淀時(shí)，一定要將離心管壁上玷污的其它糖分和碳水化合物用80％乙醇洗凈，否則結(jié)果會(huì)受影響。
關(guān)鍵詞：紫外分光光度法；枸杞多糖；靈芝多糖；；美析儀器www.macylab.com；UV-1100;UV-1200
