紫外分光光度計(jì)法測(cè)定載藥納米纖維氈的藥物釋放性能

關(guān)鍵詞：紫外分光光度計(jì)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物；美析wwww.macylab.com； 
　　

在中國(guó)、美國(guó)、英國(guó)、日本等不少國(guó)家，藥物釋放度檢查實(shí)際是指藥物固體制劑按照各國(guó)藥典規(guī)定的方法，在一定時(shí)間內(nèi)從固體制劑溶入介質(zhì)的累計(jì)百分率（以被測(cè)試劑標(biāo)示量計(jì)算）。釋放度是評(píng)價(jià)藥物制劑的質(zhì)量、固體制劑的生物利用度以及篩選固體制劑工藝、處方和劑型的重要手段[1-2]。藥物釋放度是隨著科學(xué)技術(shù)和生物藥劑學(xué)的發(fā)展而迅速發(fā)展起來的一種新的藥品檢驗(yàn)方法?，F(xiàn)有的釋放度測(cè)定方法基本上是針對(duì)緩釋制劑、控釋制劑、腸溶制劑及透皮貼劑等藥物制劑提出，對(duì)目前重點(diǎn)研究的有關(guān)載藥纖維氈的溶出度測(cè)定尚無明確的表述。 
　　載藥纖維氈中藥物含量相對(duì)于藥物制劑中載體藥物的含量低，對(duì)測(cè)試所用儀器精度要求較高；載藥纖維氈容易漂浮在緩沖溶液中不易浸潤(rùn)，從而難以保證藥物有效釋放；藥物體外釋放時(shí)需要模擬人體的真實(shí)環(huán)境（即漏槽條件的確定），一系列的問題導(dǎo)致了現(xiàn)有的試驗(yàn)裝置難以較真實(shí)地模擬載藥纖維氈的藥物釋放行為。 
　　本研究選擇美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）已批準(zhǔn)可應(yīng)用的乳酸（lactic acid）和羥基乙酸（glycolic acid）共聚物[Poly（L-lactide-co-glycolide），PLGA]為原料通過靜電紡絲制備納米纖維氈作為研究對(duì)象，以水溶性鹽酸四環(huán)素（tetracycline hydrochloride，Tet）為模擬藥物，詳細(xì)研究了采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)試和評(píng)價(jià)PLGA載藥納米纖維在模擬腸液中的體外藥物釋放行為。 
　　1 試驗(yàn)部分 
　　1.1 試驗(yàn)原料和測(cè)試儀器 
　　聚乳酸-羥基乙酸/鹽酸四環(huán)素（PLGA/Tet）靜電紡絲纖維氈由實(shí)驗(yàn)室自行制備，三氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、濃鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、氯化鈉等均為分析純。 
　　所采用的測(cè)試設(shè)備如下：臺(tái)式離心機(jī)、曲線控制真空干燥箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140A）、集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S、取液器、電子天平、精密pH計(jì)、紫外可見分光光度計(jì)、恒溫振蕩器。 
　　1.2 試驗(yàn)方法與步驟 
　　1.2.1 人工模擬腸液的配制 
　　根據(jù)2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄Ⅳ中D緩沖液的配制方法，配制pH=6.8的磷酸緩沖溶液[以下簡(jiǎn)稱為PBS（pH=6.8）緩沖溶液]作為本試驗(yàn)體外釋放的介質(zhì)。 
　　1.2.2 紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)和最小分辨率的確定 
　　利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量藥物的含量[3， 6， 11-15]，這一方法的可操作性、靈敏性和重復(fù)性是需要考慮的重要因素，吸收波長(zhǎng)和最小分辨率的確定直接決定著測(cè)試數(shù)據(jù)的有效性。 
　?。?） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 
　　稱取一定量的Tet，置于50mL容量瓶中，用PBS溶液適量振蕩使其完全溶解，加PBS溶液溶解并稀釋至刻度，作為貯備液。分別從貯備液中量取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL置于10mL的容量瓶中，用PBS溶液稀釋至刻度，搖勻，得到系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按照分光光度法[2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄Ⅳ]，選取360nm為工作波長(zhǎng)測(cè)定吸光度[9， 16]，以吸光度（A，Abs）對(duì)濃度（C，μg/mL）作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.034x+0.002（R2=0.999）。結(jié)果表明，Tet在1μg/mL～70μg/mL范圍內(nèi)濃度和吸收度呈良好的線性相關(guān)性。 
　　由此表明，在所測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，溶液的吸光度與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，具有較高的置信度。 
　?。?） 最小分辨率的確定 
　　由于紫外可見分光光度計(jì)儀器的最小分辨率為0.001Abs，最大吸光度為3.000Abs，儀器的讀數(shù)偏差在±0.004Abs的范圍內(nèi)，根據(jù)Tet在PBS緩沖溶液中的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線換算得知，儀器對(duì)藥物存在一個(gè)最小分辨率和最佳測(cè)試范圍的問題，本試驗(yàn)中儀器對(duì)Tet的測(cè)試范圍為0.03μg/mL ～88.24μg/mL。但是由于吸光度和濃度在一定的范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系，當(dāng)藥物含量低于儀器的最小分辨率時(shí)，采用紫外分光光度法測(cè)試藥物的溶解度存在較大的誤差。此時(shí)，可以選用其他精確度更高的測(cè)試方法，比如高效液相色譜法等[4， 17-18]。而當(dāng)藥物濃度太高時(shí)，吸光度與濃度的關(guān)系就偏離了線性范圍。所以，紫外可見分光光度計(jì)測(cè)試藥物的釋放度存在一個(gè)最佳測(cè)試范圍。本試驗(yàn)中，Tet對(duì)PBS緩沖溶液的最佳測(cè)試范圍為1μg/mL～70μg/mL。 
　　1.2.3 纖維氈載藥量的測(cè)定 
　　本試驗(yàn)條件是模擬人體腸液的環(huán)境，故選用人體的溫度（37±0.5）℃為溶出介質(zhì)溫度。 
　　采用萃取法測(cè)定納米纖維的載藥量。取待測(cè)纖維膜10mg，溶解在5mL的三氯甲烷中，加入10mL的PBS溶液，超聲振蕩，以30min為時(shí)間間隔，不同時(shí)間取上層清液，高速離心機(jī)5000rpm的速度離心6 min后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)溶液的吸光度。當(dāng)吸光度不再改變，表示藥物已經(jīng)完全從溶解的三氯甲烷中溶解萃取出來。通過對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得藥物的濃度，再通過換算得到纖維膜的載藥量。 　

1.2.4 纖維氈藥物體外釋放度的測(cè)定 
　　方法一[4-6， 8-9]：取待測(cè)纖維膜10mg，浸入含5mL PBS緩沖溶液的具塞試管中，并將具塞試管放入恒溫振蕩器中（37℃，120r/min）恒溫振蕩，于一定時(shí)間分別取出納米纖維膜，同時(shí)加入5mL恒溫后的相應(yīng)新鮮緩沖液。按照分光光度法[2010年版《中國(guó)藥典》（二部）附錄Ⅳ]檢測(cè)待測(cè)溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各取樣時(shí)間釋放液中的藥物濃度，計(jì)算各取樣時(shí)間的累計(jì)釋放量，累積釋放量與實(shí)際藥物含量的比值，即為各取樣時(shí)間藥物的累計(jì)釋放百分率。藥物累計(jì)濃度的計(jì)算公式為 
　　方法二[3， 7， 20]：體外釋放測(cè)定之前，先確定藥物于37℃時(shí)在PBS中的溶解度。稱取過量的鹽酸四環(huán)素藥物于一定量的PBS溶液中，在（37±0.5）℃的恒溫水浴中攪拌2h待充分溶解，靜置24h，取上層清液離心（5000rpm，2min），加入PBS緩沖溶液稀釋搖勻后于最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)試溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其飽和溶解度。 
　　根據(jù)溶解度計(jì)算出溶解實(shí)際載藥量的藥物所需的介質(zhì)體積。本試驗(yàn)中，為了與方法一對(duì)比，我們固定釋放介質(zhì)體積為10mL，按照漏槽條件反推換算成所需的納米纖維氈質(zhì)量（如5%Tet/PLGA/PBS，稱取15mg纖維膜；8%Tet/PLGA/PBS，稱取10mg纖維膜），浸入含10mLPBS緩沖溶液的25mL錐形瓶中，然后將錐形瓶放入恒溫振蕩器中（37℃，120rpm），一定時(shí)間分別用取液器吸取1mL溶液備測(cè)，同時(shí)加入1mL恒溫后的相應(yīng)新鮮緩沖液。檢測(cè)待測(cè)溶液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各取樣時(shí)間釋放液中的藥物濃度，計(jì)算各時(shí)間的累計(jì)釋放量，除以實(shí)際藥物含量，即得各取樣時(shí)間藥物的累計(jì)釋放率。另外需要對(duì)藥物濃度校正，校正公式為： 
　　上述所有測(cè)試，對(duì)每一個(gè)樣品進(jìn)行3次平行測(cè)定。 
　　2 結(jié)果與討論 
　　2.1 紫外分光光度計(jì)法的可行性分析 
　　為了研究紫外分光光度計(jì)法的準(zhǔn)確性和可行性，我們對(duì)同一個(gè)載藥纖維膜在三處不同的部位取樣，利用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)量藥物釋放度，結(jié)果如圖1。 
　　從圖1可以看出，對(duì)同一個(gè)納米纖維氈樣品，利用紫外分光光度計(jì)3次測(cè)量得出的釋放曲線整體趨勢(shì)相似，都是先突釋、后緩釋，曲線拐點(diǎn)都出現(xiàn)在8h的取樣點(diǎn)處。累計(jì)釋放率存在的偏差，原因主要在于所紡納米纖維氈各處藥物分布并不能達(dá)到完全一致，不同取樣部位載藥量會(huì)有一定的差別，但是偏差都在4%以內(nèi)。另外，當(dāng)藥物釋放一定時(shí)間之后，釋藥曲線會(huì)出現(xiàn)一定程度下降。這可能是因?yàn)椴捎梅椒ǘ械墓接?jì)算累計(jì)釋放率時(shí)，當(dāng)某兩個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)內(nèi)藥物釋放量較小時(shí)，釋放介質(zhì)整體的濃度變化較小，從而實(shí)際吸光度變化也很小。本試驗(yàn)中所用紫外分光光度計(jì)讀數(shù)偏差在±0.004的范圍內(nèi)。將這一微小的偏差根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線反推得到的濃度也會(huì)有一定的偏差，從而使得累計(jì)釋放率出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。同時(shí)，藥物釋放的后期，纖維膜表面由于藥物釋放溶解后形成的納米微孔，導(dǎo)致纖維氈有一定的降解和藥物的反吸附。故當(dāng)藥物濃度低于儀器的測(cè)量精確度時(shí)，為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，可以考慮精確度更高的測(cè)試方法，比如高效液相色譜法等。 
　　對(duì)于同一樣品，不同測(cè)試日期，測(cè)試載藥纖維氈藥物釋放性能，其結(jié)果如圖2所示。由圖可見，不同測(cè)試日期，載藥纖維氈表現(xiàn)出一致的藥物釋放趨勢(shì)。這些結(jié)果充分說明本試驗(yàn)采用紫外分光光度計(jì)法的可行性。 
　　2.2 漏槽條件對(duì)纖維氈緩釋性能的影響 
　　釋放介質(zhì)的體積應(yīng)符合漏槽條件。漏槽狀態(tài)即藥物所處釋放介質(zhì)的濃度遠(yuǎn)小于其飽和濃度。漏槽狀態(tài)的生理學(xué)解釋為：藥物在體內(nèi)被迅速吸收，制劑的體外包括釋放度等測(cè)定需要模仿體內(nèi)生理?xiàng)l件的，滿足藥物溶解—吸收的過程。漏槽條件起到了修正作用，一般釋放介質(zhì)的體積為藥物飽和溶液所需介質(zhì)體積的3～7倍。因此需要釋藥系統(tǒng)在體內(nèi)處于這樣的狀態(tài)。根據(jù)漏槽條件和藥物溶解度，調(diào)整不同藥物含量纖維膜的質(zhì)量和釋放介質(zhì)的體積，使得實(shí)際藥物體外釋放體系更接近體內(nèi)生理?xiàng)l件。 
　　本文建立了兩種釋放度測(cè)定方法，方法一未考慮漏槽條件來選擇釋放介質(zhì)的體積，只保證藥物可完全溶解。方法二嚴(yán)格按照漏槽條件要求確定釋放介質(zhì)體積。兩種方法所測(cè)得藥物釋放率如圖3所示。從圖可以看出，同一時(shí)刻，方法二藥物的釋放率比方法一高達(dá)20%。這是因?yàn)榉椒ǘ嗅尫沤橘|(zhì)體積遠(yuǎn)大于藥物完全溶解所需的體積。藥物從纖維膜上擴(kuò)散到介質(zhì)中的速率受濃度梯度和藥物溶蝕的影響，釋放介質(zhì)越多，濃度梯度越大，藥物的遷移速度越快，釋放率越高。當(dāng)藥物在人體內(nèi)釋放時(shí)，人體內(nèi)的腸液或組織液都不是靜止?fàn)顟B(tài)，會(huì)及時(shí)帶走釋放出來的藥物。這就相當(dāng)于介質(zhì)體積很大，也即漏槽條件是模擬人體內(nèi)釋放環(huán)境的一個(gè)必要因素。 
　　方法一中，把纖維膜全部取出，藥物和緩沖溶液在纖維膜上的殘留和損失、量取新鮮溶液的體積誤差、纖維膜的鋪展程度、操作時(shí)間誤差及藥物在溶液中的溶解度都會(huì)影響方法一測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。更重要的是，方法一未考慮藥物在體外釋放體系的溶解度和漏槽條件，不能更好地模擬人體體外釋放的真實(shí)條件。調(diào)整后的測(cè)試藥物釋放方法（方法二）比之前把纖維膜取出、完全更換緩沖液的方法（方法一）更接近藥物體外釋放的情況，特別對(duì)于纖維膜容易降解（逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)樗槠屠w維膜在緩沖溶液中逐漸腐爛）的情況，方法二更準(zhǔn)確。