保健食品中9種脂溶性維生素的測(cè)定
1范圍
本方法規(guī)定了營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑類(lèi)保健食品中維生素A、維生素A醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素K1、維生素K2、β-胡蘿卜素含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。
本方法適用于營(yíng)養(yǎng)素補(bǔ)充劑類(lèi)保健食品中維生素A、維生素A醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素K1、維生素K2、β-胡蘿卜素含量的測(cè)定。
2原理
試樣經(jīng)混合溶液（異丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80，v:v:v）提取后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量。
3試劑和材料
除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。
3.1 試劑
3.1.1甲醇：質(zhì)譜級(jí)。
3.1.2乙腈：質(zhì)譜級(jí)。
3.1.3異丙醇：色譜純。
3.1.4丙酮。
3.1.5二氯甲烷。
3.1.6提取溶液（異丙醇：二氯甲烷：甲醇=10:10:80，v:v:v）：取異丙醇50mL、二氯甲烷50mL，用甲醇稀釋至500 mL，混勻。
3.1.7 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1 mL用水稀釋至1 000 mL，用濾膜（3.4）過(guò)濾后備用。
3.1.8 0.1%甲酸甲醇溶液：取甲酸1 mL用甲醇稀釋至1000mL，用濾膜（3.4）過(guò)濾后備用。
3.2標(biāo)準(zhǔn)品
維生素A、維生素A醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素K1、維生素K2、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見(jiàn)附錄A表A.1，純度≥98%。
3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
3.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/mL）
3.3.1.1維生素K1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱(chēng)取0.01 g（精確至0.000 1 g）的維生素K1標(biāo)準(zhǔn)品（3.2），加入5mL丙酮（3.1.4）溶解，用甲醇轉(zhuǎn)移并定容于100 mL棕色容量瓶中。
3.3.1.2 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱(chēng)取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（3.2）0.01 g（精確至0.000 1 g），用二氯甲烷（3.1.5）溶解，轉(zhuǎn)移并定容至100 mL棕色容量瓶中。
3.3.1.3維生素A、維生素A醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素K2標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱(chēng)取0.01 g（精確至0.000 1 g）的維生素A、維生素A醋酸酯、維生素D2、維生素D3、維生素E、維生素E醋酸酯、維生素K2標(biāo)準(zhǔn)品（3.2），用甲醇溶解，轉(zhuǎn)移并定容至100 mL棕色容量瓶中。
3.3.2 空白基質(zhì)溶液的配制
取空白試樣按照試樣制備方法 (5.2)操作。
3.3.3基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液配制
準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.3.1）適量，用空白基質(zhì)溶液稀釋。此溶液中維生素A、維生素A醋酸酯、維生素D2含量為0.01 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL，維生素D3含量為0.02μg/mL、0.05 μg/mL、0.1μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL，維生素E、維生素E醋酸酯含量為0.1μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，維生素K1、維生素K2含量為0.005 μg/mL、0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.25 μg/mL，β-胡蘿卜素含量為0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2.5 μg/mL，臨用時(shí)配制。
注：操作過(guò)程應(yīng)在避光環(huán)境下進(jìn)行。
3.4微孔濾膜：0.22 μm，有機(jī)相。
4儀器和設(shè)備
4.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有大氣壓化學(xué)離子源。
4.2 超聲波清洗器。
4.3分析天平：感量分別為0.01 g和0.000 1 g。
5分析步驟
5.1 試樣制備
將20粒片劑或膠囊試樣粉碎后混勻，液體試樣混合均勻。
5.2 試樣提取
準(zhǔn)確稱(chēng)取混合均勻的試樣2g（精確至0.01 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入40 mL提取溶液（3.1.6），超聲20 min，冷卻至室溫，用提取溶液（3.1.6）定容至刻度，搖勻，上清液經(jīng)微孔濾膜（3.4）過(guò)濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。
注：操作過(guò)程應(yīng)在避光環(huán)境下進(jìn)行。
5.3 儀器參考條件
5.3.1 色譜條件
a）色譜柱： C18柱，1.7 μm，100 mm×2.1 mm（內(nèi)徑），或性能相當(dāng)者。
b）流動(dòng)相：A 為0.1%甲酸水溶液（3.1.7），B為0.1%甲酸甲醇溶液（3.1.8），洗脫梯度見(jiàn)表1。
c）流速：0.5 mL/min。
d）柱溫：35℃。
e）進(jìn)樣量：5 μL。
表1 洗脫梯度
|
時(shí)間（min） |
流動(dòng)相A（%） |
流動(dòng)相B（%） |
|
0 |
15 |
85 |
|
3 |
0 |
100 |
|
8.5 |
0 |
100 |
|
8.51 |
15 |
85 |
|
10 |
15 |
85 |
5.3.2 質(zhì)譜條件
a）電離方式：大氣壓化學(xué)正離子模式。
b）檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）。
c）霧化氣壓力：45psi。
d）離子噴霧電壓：4500V。
e）干燥氣溫度：200 ℃（測(cè)定維生素D2）、350 ℃（測(cè)定其余8種維生素）。
f）干燥氣流速：6 L/min。
g）定性離子對(duì)、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。
表2 脂溶性維生素的定性離子對(duì)、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量
|
中文名稱(chēng) |
母離子(m/z) |
子離子(m/z) |
碎裂電壓( V) |
碰撞能量(eV) |
|
維生素A |
269.2 |
93.1*；81.2 |
135 |
22；22 |
|
維生素A醋酸酯 |
328.1 |
93.1*；81.2 |
135 |
22；22 |
|
維生素D2 |
397.3 |
69.2*；107.3 |
135 |
18；35 |
|
維生素D3 |
385.3 |
367.2*；259.1 |
135 |
5；5 |
|
維生素E |
431.4 |
165.2*；137.3 |
135 |
5；40 |
|
維生素E醋酸酯 |
473.3 |
207.3*；165.3 |
100 |
8；30 |
|
維生素K1 |
451.1 |
187.2*；57.3 |
135 |
20；30 |
|
維生素K2 |
445.2 |
187.3*；81.2 |
135 |
20；40 |
|
β-胡蘿卜素 |
538.4 |
177.2*；121.3 |
100 |
10；20 |
* ：定量離子
5.4 定性測(cè)定
按照上述條件測(cè)定試樣和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中的某種組分一致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)）；試樣中定性離子對(duì)的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過(guò)表3規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。
表3 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差
|
相對(duì)離子豐度（%） |
＞50 |
＞20~50 |
＞10~20 |
≤10 |
|
允許的最大偏差（%） |
± 20 |
± 25 |
± 30 |
± 50 |
5.5 定量測(cè)定
5.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.3）分別按儀器參考條件（5.3）進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積。以混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
5.5.2 試樣溶液的測(cè)定
將試樣溶液（5.2）按儀器參考條件（5.3）進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)的樣品溶液的色譜峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中組分的濃度，平行測(cè)定次數(shù)不少于兩次；試樣待測(cè)液響應(yīng)值若低于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，應(yīng)取5.2中試樣提取續(xù)濾液進(jìn)行分析；試樣待測(cè)液響應(yīng)值若超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，應(yīng)用提取溶液（3.1.6）稀釋后進(jìn)行分析。
標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖參見(jiàn)附錄B的圖B.1-B.9。
6結(jié)果計(jì)算
結(jié)果按式（1）計(jì)算：
…………………………………………（1）
式中：
X—試樣中某種組分的含量，單位為微克每百克（μg/100g）；
c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣液中某種組分的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；
V—試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；
m—試樣稱(chēng)取的質(zhì)量，單位為克（g）；
計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。
7精密度
在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%。
8其他
當(dāng)稱(chēng)樣量為2.00 g，定容體積為50 mL時(shí)，維生素A、維生素A醋酸酯、維生素D2檢出限為8μg/100g，定量限為25μg/100g；維生素D3、維生素E檢出限為15μg/100g，定量限為50μg/100g；維生素E醋酸酯、維生素K1、維生素K2檢出限為4μg/100g，定量限為12.5μg/100g；β-胡蘿卜素檢出限為40μg/100g，定量限為125μg/100g。
附錄A
脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品信息
表A.1 脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱(chēng)、英文名稱(chēng)、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量
|
序號(hào) |
中文名稱(chēng) |
英文名稱(chēng) |
CAS登錄號(hào) |
分子式 |
相對(duì)分子量 |
|
1 |
維生素A |
Retinol |
68-26-8 |
C20H30O |
286.45 |
|
2 |
維生素A醋酸酯 |
Retinol Acetate |
127-47-9 |
C22H32O2 |
328.49 |
|
3 |
維生素D2 |
Calciferol |
50-14-6 |
C28H44O |
396.65 |
|
4 |
維生素D3 |
Cholecalciferol |
67-97-0 |
C27H44O |
384.64 |
|
5 |
維生素E |
α-Tocopherol |
59-02-9 |
C29H50O2 |
430.71 |
|
6 |
維生素E醋酸酯 |
Tocopheryl Acetate |
7695-91-2 |
C31H52O3 |
472.74 |
|
7 |
維生素K1 |
Phytomenadione |
C31H46O2 |
450.71 |
|
|
8 |
維生素K2 |
Farnoquinone |
11032-49-8 |
C16H16O2.(C5H8)3 |
444.66 |
|
9 |
β-胡蘿卜素 |
β-Carotene |
C40H56 |
536.87 |
附錄B
脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖
本方法負(fù)責(zé)起草單位：中國(guó)食品藥品檢定研究院。
驗(yàn)證單位：山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院、武漢市食品化妝品檢驗(yàn)所、天津市藥品檢驗(yàn)所、中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所、廈門(mén)市藥品檢驗(yàn)研究院。
主要起草人：寧霄、金紹明、曹進(jìn)、王聰、孔璇、賈艾玲
