保健食品中9種水溶性維生素的測(cè)定

1      范圍

本方法規(guī)定了保健食品中維生素B₁、維生素B₂、泛酸、維生素B₆、生物素、葉酸、維生素B₁₂、煙酸、煙酰胺含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

本方法適用于營養(yǎng)素補(bǔ)充劑類保健食品中維生素B₁、維生素B₂、泛酸、維生素B₆、生物素、葉酸、維生素B₁₂、煙酸、煙酰胺含量的測(cè)定。

2      原理

試樣經(jīng)水提取后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)，外標(biāo)法定量。

3      試劑和材料

注：除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1 試劑

3.1.1甲醇：質(zhì)譜級(jí)。

3.1.2甲酸：質(zhì)譜級(jí)。

3.1.3氨水：含量26%。

3.1.4冰醋酸。

3.1.5 濃鹽酸。

3.1.6氨水（1+5）：量取100 mL 氨水（3.1.3）緩慢倒入500 mL 水中，混勻。

3.1.7 鹽酸（0.01 mol/L）：吸取9 mL 濃鹽酸（3.1.5），溶于1000 mL 水中。吸取該溶液50 mL，用水稀釋并定容至500 mL。

3.1.8 0.1%甲酸水溶液：取甲酸1 mL用水稀釋至1 000 mL，用濾膜（3.4）過濾后備用。

3.1.9 0.1%甲酸甲醇溶液：取甲酸1 mL用甲醇稀釋至1000mL，用濾膜（3.4）過濾后備用。

3.2標(biāo)準(zhǔn)品

維生素B₁（硫胺素鹽酸鹽）、維生素B₂、泛酸（泛酸鈣）、維生素B₆（吡哆醇）、生物素、葉酸、維生素B₁₂、煙酸、煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量見附錄A表A.1，純度≥98%。

3.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1 mg/mL）

3.3.1.1維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取維生素 B₁標(biāo)準(zhǔn)品（3.2）0.1 g（精確至0.000 1 g），用 0.01 mol/L 鹽酸（3.1.7）溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中。

3.3.1.2維生素B₂、生物素、葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取生物素、葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（3.2）0.1 g（精確至0.000 1 g），加入30 mL氨水（3.1.6）溶解，甲酸調(diào)節(jié)pH值至7.0后，用水轉(zhuǎn)移并定容至100 mL棕色容量瓶中。

3.3.1.3 維生素B₆、維生素B₁₂、煙酸、煙酰胺、泛酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取維生素B₆、維生素B₁₂、煙酸、煙酰胺和泛酸標(biāo)準(zhǔn)品（3.2）0.1 g（精確至0.000 1 g），用水溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中。

3.3.2 空白基質(zhì)溶液的配制

取空白試樣按照試樣制備方法（5.2）操作。

3.3.3基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液

3.3.3.1維生素B₁基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取維生素B₁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.3.1）適量，用空白基質(zhì)溶液（3.3.2）將其稀釋成含量分別為0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

3.3.3.2 8種維生素基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取維生素B₂、泛酸、生物素、維生素B₆、葉酸、維生素B₁₂、煙酸、煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.3.1）適量，用空白基質(zhì)溶液將其稀釋成含量分別為0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

注：操作過程應(yīng)在避光環(huán)境下進(jìn)行。

3.4微孔濾膜：0.22 μm，有機(jī)相。

4      儀器和設(shè)備

4.1 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。

4.2 超聲波清洗器。

4.3 分析天平：感量分別為0.01 g和0.000 1 g。

5      分析步驟

5.1試樣制備

將20粒片劑或膠囊試樣粉碎后混勻，液體試樣混合均勻。

5.2試樣提取

準(zhǔn)確稱取混合均勻的試樣2g（精確至0.01 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入40mL水，超聲10 min，冷卻至室溫，用水定容至刻度，搖勻，上清液經(jīng)微孔濾膜（3.4）過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

注：操作過程應(yīng)在避光環(huán)境下進(jìn)行。

5.3 儀器參考條件

5.3.1 色譜條件

a）色譜柱： HSS T3柱，1.8 μm，100 mm×2.1 mm（內(nèi)徑），或性能相當(dāng)者；

b）流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液（3.1.8），B為0.1%甲酸甲醇溶液（3.1.9），洗脫梯度見表1；

c）流速：0.3 mL/min；

d）柱溫：30℃；

e）進(jìn)樣量：2 μL。

表1 洗脫梯度

5.3.2 質(zhì)譜條件

a）電離方式：電噴霧正離子模式。

b）檢測(cè)方式：多反應(yīng)檢測(cè)（MRM）。

c）霧化氣壓力：45psi。

d）離子噴霧電壓：3500V。

e）干燥氣溫度：300℃。

f）干燥氣流速：5 L/min。

g）定性離子對(duì)、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量見表2。

表2 水溶性維生素的定性離子對(duì)、定量離子、碎裂電壓和碰撞能量

* ：定量離子

5.4 定性測(cè)定

按照上述條件測(cè)定試樣和混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與混合標(biāo)準(zhǔn)工作液中的某種組分一致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)）；試樣中定性離子對(duì)的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過表3規(guī)定的范圍，則可判定為試樣中存在該組分。

表3 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

5.5 定量測(cè)定

5.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

    將基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.3.3）分別按儀器參考條件（5.3）進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜峰面積。以基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

5.5.2 試樣溶液的測(cè)定

    將試樣溶液（5.2）按儀器參考條件（5.3）進(jìn)行測(cè)定，得到相應(yīng)的樣品溶液的色譜峰面積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)液中組分的濃度，平行測(cè)定次數(shù)不少于兩次；試樣待測(cè)液響應(yīng)值若低于標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，應(yīng)取5.2中試樣提取續(xù)濾液進(jìn)行分析；試樣待測(cè)液響應(yīng)值若超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍，應(yīng)用水稀釋后進(jìn)行分析。

標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖參見附錄B的圖B.1-B.9。

6      結(jié)果計(jì)算

結(jié)果按式（1）計(jì)算：

…………………………………………（1）

式中：

X—試樣中某種組分的含量，單位為微克每百克（μg/100g）；

c—由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的樣液中某種組分的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V—試樣溶液定容體積，單位為毫升（mL）；

m—試樣稱取的質(zhì)量，單位為克（g）；

計(jì)算結(jié)果以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

7      精密度

在重復(fù)條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。

8      其他

當(dāng)稱樣量為2.00 g，定容體積為50 mL時(shí)，維生素B₁、維生素B₆、葉酸檢出限為2.5μg/100g，定量限為10μg/100g；維生素B₂、泛酸、煙酸、煙酰胺檢出限為5μg/100g，定量限為15μg/100g；生物素、維生素B₁₂檢出限為7.5μg/100g，定量限為25μg/100g。

附錄A

水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品信息

表A.1 水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品的中文名稱、英文名稱、CAS登錄號(hào)、分子式、相對(duì)分子量