紫外·可見(jiàn)分光光度計(jì)之朗伯-比爾定律及影響因素
發(fā)布日期：2019-11-22 點(diǎn)擊次數(shù)：
當(dāng)單色光通過(guò)液層厚度一定的含吸光物質(zhì)的溶液后，一些光子被吸收，光強(qiáng)就從 I0 降到 I 。I和I0的比值用透光率T（transmittance）表示，T=I/I0。
透光率的負(fù)對(duì)數(shù)可用于表示入射光被吸收的程度，稱為吸光度A(absorbance),即A =-lgT。從此式可以看出，物質(zhì)的透光率越大，吸光度越小，對(duì)光的吸收越弱，反之對(duì)光的吸收越強(qiáng)。
物質(zhì)對(duì)單色光的吸收度A與吸光物質(zhì)的溶液濃度c和液層厚度l的關(guān)系可以用朗伯-比爾定律描述。其中，朗伯定律解釋了吸收度A與液層厚度l的關(guān)系，比爾定律解釋了吸收度A與吸光物質(zhì)的溶液濃度c的關(guān)系。
朗伯-比爾定律（Lambert-Beer）是吸收光譜的基本定律(適用條件:稀溶液，單色光),它的數(shù)學(xué)表達(dá)式為: A = Ecl, E為吸收系數(shù)。此公式的物理意義是，當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)均勻的含有吸光物質(zhì)的溶液后，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)濃度c及吸收層厚度l成正比。
吸收系數(shù)E是指一定波長(zhǎng)下，吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的吸光度。在單色光、溶劑、溫度等條件一定下，吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征常數(shù)，可作為定性分析的依據(jù)和定量分析靈敏度的估量。在一定條件下，物質(zhì)的吸光系數(shù)越大，吸光能力越強(qiáng)。根據(jù)所采用的濃度單位，可以分為摩爾吸收系數(shù)ε和百分吸收系數(shù)。
1）摩爾吸收系數(shù)ε
摩爾吸收系數(shù)ε，單位為L(zhǎng)/(mol*cm)，指在一定波長(zhǎng)下，吸光物質(zhì)溶液濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時(shí)的吸光度。實(shí)際工作時(shí)單位可省略不寫(xiě)。
摩爾吸收系數(shù)ε可分為強(qiáng)吸收、弱吸收和中強(qiáng)吸收。大于10000為強(qiáng)吸收，小于100為弱吸收，100~10000為中強(qiáng)吸收，摩爾吸收系數(shù)ε一般不大于100000。
2）百分吸收系數(shù)
百分吸收系數(shù)又稱為吸收系數(shù)，單位為100ml/(g*cm),指在一定波長(zhǎng)下，吸光物質(zhì)溶液濃度為1%（g*cm），液層厚度為1cm時(shí)的吸光度。百分吸收系數(shù)在藥物測(cè)定中應(yīng)用更廣泛，《中國(guó)藥典》均采用百分吸收系數(shù)，實(shí)際工作中單位也可省略不寫(xiě)。
二、偏離比爾定律的因素
按照比爾定律，當(dāng)入社單色光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度和溶液的液層厚度一定時(shí)，吸光度對(duì)溶液濃度所作的曲線應(yīng)為一條過(guò)原點(diǎn)直線，但是在實(shí)際工作中，往往會(huì)偏離線性而發(fā)生彎曲。
曲線在實(shí)驗(yàn)中是否為直線取決于兩個(gè)因素。一是比爾定律的前提條件：稀溶液。在溶液濃度大時(shí)（通常大于0.01mol/L），吸光質(zhì)點(diǎn)的距離減小，彼此間的相互作用改變了它們吸收給定波長(zhǎng)的輻射能力造成偏離直線。二是能否控制好影響吸光度測(cè)量的因素，主要是化學(xué)因素和光學(xué)因素兩大類。
1） 化學(xué)因素（與樣品有關(guān)）
①濃度較大時(shí)，吸光粒子距離減小，影響其電荷分布，使其吸收給定波長(zhǎng)光的能力改變；
②溶液對(duì)光折射率有顯著改變
③吸光物質(zhì)有離解、締合、光化作用、互變作用、或與溶劑的相互作用以及溶劑的影響。
由化學(xué)因素引起的Beer偏離，有時(shí)可通過(guò)控制溶液條件（如濃度，酸度，溫度，時(shí)間等）設(shè)法減免
2）光學(xué)因素（與儀器有關(guān)）
1）非單色光
比爾定律只適用于單色光。但紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)為了保證足夠的光強(qiáng)度，使用的是具有一定譜帶寬度的光源，必須要采用單色器把所需的波長(zhǎng)從連續(xù)光譜中分離出來(lái)。分離的波長(zhǎng)的寬度取決于單色器的狹縫寬度和棱鏡或光柵的分辨率。由于技術(shù)的限制，狹縫寬度不可能無(wú)限的小，所以實(shí)際測(cè)定中入射光不可能絕對(duì)單色，因此入射光不僅含有所需波長(zhǎng)的光，還會(huì)有附近波長(zhǎng)的光。
入射光不純：
①影響A與c的關(guān)系不成線性，即偏離比爾定律。
②嚴(yán)重影響物質(zhì)的吸光系數(shù)值和吸收光譜形狀（變形）。
2）雜散光
雜散光指的是一些不在譜帶寬度范圍內(nèi)的與所需波長(zhǎng)相隔較遠(yuǎn)的光。
①雜散光的來(lái)源：
儀器光學(xué)系統(tǒng)的缺陷，儀器保養(yǎng)不善，光學(xué)元件受塵染或霉蝕。
②影響：
雜散光可使吸收光譜變形，也會(huì)使吸光度值改變。但現(xiàn)代儀器雜散光的影響可以忽略不計(jì)。
3）散射光和反射光
入射光通過(guò)吸收池內(nèi)外界面時(shí)，界面可產(chǎn)生反射作用；入射光通過(guò)測(cè)試液時(shí)，會(huì)產(chǎn)生散射作用。因此測(cè)量A值時(shí)，光強(qiáng)度的減弱并不完全是吸光物質(zhì)的吸收，還有：
①溶劑、容器的吸收
②吸光質(zhì)點(diǎn)，溶劑分子的散射
③吸收池內(nèi)、外界面的反射
可通過(guò)空白對(duì)比進(jìn)行補(bǔ)償以抵消反射作用和散射作用的影響。
4）非平行光
如果以一定角度傾斜光通過(guò)吸收池，非平行光的實(shí)際光程會(huì)比垂直照射時(shí)的平行光光程增大，導(dǎo)致偏離朗伯-比爾定律，使A值偏高。故吸收池不得傾斜放置光路中。
透光率的負(fù)對(duì)數(shù)可用于表示入射光被吸收的程度，稱為吸光度A(absorbance),即A =-lgT。從此式可以看出，物質(zhì)的透光率越大，吸光度越小，對(duì)光的吸收越弱，反之對(duì)光的吸收越強(qiáng)。
物質(zhì)對(duì)單色光的吸收度A與吸光物質(zhì)的溶液濃度c和液層厚度l的關(guān)系可以用朗伯-比爾定律描述。其中，朗伯定律解釋了吸收度A與液層厚度l的關(guān)系，比爾定律解釋了吸收度A與吸光物質(zhì)的溶液濃度c的關(guān)系。
朗伯-比爾定律（Lambert-Beer）是吸收光譜的基本定律(適用條件:稀溶液，單色光),它的數(shù)學(xué)表達(dá)式為: A = Ecl, E為吸收系數(shù)。此公式的物理意義是，當(dāng)一束平行的單色光通過(guò)均勻的含有吸光物質(zhì)的溶液后，溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)濃度c及吸收層厚度l成正比。
吸收系數(shù)E是指一定波長(zhǎng)下，吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)的吸光度。在單色光、溶劑、溫度等條件一定下，吸光系數(shù)是物質(zhì)的特征常數(shù)，可作為定性分析的依據(jù)和定量分析靈敏度的估量。在一定條件下，物質(zhì)的吸光系數(shù)越大，吸光能力越強(qiáng)。根據(jù)所采用的濃度單位，可以分為摩爾吸收系數(shù)ε和百分吸收系數(shù)。
1）摩爾吸收系數(shù)ε
摩爾吸收系數(shù)ε，單位為L(zhǎng)/(mol*cm)，指在一定波長(zhǎng)下，吸光物質(zhì)溶液濃度為1mol/L，液層厚度為1cm時(shí)的吸光度。實(shí)際工作時(shí)單位可省略不寫(xiě)。
摩爾吸收系數(shù)ε可分為強(qiáng)吸收、弱吸收和中強(qiáng)吸收。大于10000為強(qiáng)吸收，小于100為弱吸收，100~10000為中強(qiáng)吸收，摩爾吸收系數(shù)ε一般不大于100000。
2）百分吸收系數(shù)
百分吸收系數(shù)又稱為吸收系數(shù)，單位為100ml/(g*cm),指在一定波長(zhǎng)下，吸光物質(zhì)溶液濃度為1%（g*cm），液層厚度為1cm時(shí)的吸光度。百分吸收系數(shù)在藥物測(cè)定中應(yīng)用更廣泛，《中國(guó)藥典》均采用百分吸收系數(shù)，實(shí)際工作中單位也可省略不寫(xiě)。
二、偏離比爾定律的因素
按照比爾定律，當(dāng)入社單色光的波長(zhǎng)、強(qiáng)度和溶液的液層厚度一定時(shí)，吸光度對(duì)溶液濃度所作的曲線應(yīng)為一條過(guò)原點(diǎn)直線，但是在實(shí)際工作中，往往會(huì)偏離線性而發(fā)生彎曲。
曲線在實(shí)驗(yàn)中是否為直線取決于兩個(gè)因素。一是比爾定律的前提條件：稀溶液。在溶液濃度大時(shí)（通常大于0.01mol/L），吸光質(zhì)點(diǎn)的距離減小，彼此間的相互作用改變了它們吸收給定波長(zhǎng)的輻射能力造成偏離直線。二是能否控制好影響吸光度測(cè)量的因素，主要是化學(xué)因素和光學(xué)因素兩大類。
1） 化學(xué)因素（與樣品有關(guān)）
①濃度較大時(shí)，吸光粒子距離減小，影響其電荷分布，使其吸收給定波長(zhǎng)光的能力改變；
②溶液對(duì)光折射率有顯著改變
③吸光物質(zhì)有離解、締合、光化作用、互變作用、或與溶劑的相互作用以及溶劑的影響。
由化學(xué)因素引起的Beer偏離，有時(shí)可通過(guò)控制溶液條件（如濃度，酸度，溫度，時(shí)間等）設(shè)法減免
2）光學(xué)因素（與儀器有關(guān)）
1）非單色光
比爾定律只適用于單色光。但紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)為了保證足夠的光強(qiáng)度，使用的是具有一定譜帶寬度的光源，必須要采用單色器把所需的波長(zhǎng)從連續(xù)光譜中分離出來(lái)。分離的波長(zhǎng)的寬度取決于單色器的狹縫寬度和棱鏡或光柵的分辨率。由于技術(shù)的限制，狹縫寬度不可能無(wú)限的小，所以實(shí)際測(cè)定中入射光不可能絕對(duì)單色，因此入射光不僅含有所需波長(zhǎng)的光，還會(huì)有附近波長(zhǎng)的光。
入射光不純：
①影響A與c的關(guān)系不成線性，即偏離比爾定律。
②嚴(yán)重影響物質(zhì)的吸光系數(shù)值和吸收光譜形狀（變形）。
2）雜散光
雜散光指的是一些不在譜帶寬度范圍內(nèi)的與所需波長(zhǎng)相隔較遠(yuǎn)的光。
①雜散光的來(lái)源：
儀器光學(xué)系統(tǒng)的缺陷，儀器保養(yǎng)不善，光學(xué)元件受塵染或霉蝕。
②影響：
雜散光可使吸收光譜變形，也會(huì)使吸光度值改變。但現(xiàn)代儀器雜散光的影響可以忽略不計(jì)。
3）散射光和反射光
入射光通過(guò)吸收池內(nèi)外界面時(shí)，界面可產(chǎn)生反射作用；入射光通過(guò)測(cè)試液時(shí)，會(huì)產(chǎn)生散射作用。因此測(cè)量A值時(shí)，光強(qiáng)度的減弱并不完全是吸光物質(zhì)的吸收，還有：
①溶劑、容器的吸收
②吸光質(zhì)點(diǎn)，溶劑分子的散射
③吸收池內(nèi)、外界面的反射
可通過(guò)空白對(duì)比進(jìn)行補(bǔ)償以抵消反射作用和散射作用的影響。
4）非平行光
如果以一定角度傾斜光通過(guò)吸收池，非平行光的實(shí)際光程會(huì)比垂直照射時(shí)的平行光光程增大，導(dǎo)致偏離朗伯-比爾定律，使A值偏高。故吸收池不得傾斜放置光路中。
