亞硝酸鈉－硝酸鋁比色法檢測黔中金蕎麥黃酮含量的分析試驗

關(guān)鍵詞:黔中金蕎麥;總黃酮;蘆丁;分光光度法;美析集團(tuán)（www.macylab.com)

金蕎麥具有抗菌、抗感染、解熱抗炎、抗血小板聚集、抗突變、提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能以及抗腫瘤等多種生物活性，這與金蕎麥中含有黃酮類化合物，如蕓香甙、山茶酚-3-蕓香糖苷、槲皮素、槲皮素蕓香糖苷-7-半乳糖苷等有關(guān)。黃酮類化合物是植物的重要次生代謝產(chǎn)物，為1類重要的天然有機(jī)化合物，能清除生物體內(nèi)的自由基，具有抗氧化作用。目前黃酮的分析方法主要包括液相色譜法和分光光度法，其中分光光度法操作簡單、快速、成本低，應(yīng)用廣泛。測定黃酮的分光光度法主要有

NaNO₂－Al(NO₃)₃－NaOH法、NaNO₂－AlCl₃－NaOH顯色法和AlCl₃－KAC法。因黃酮的基本結(jié)構(gòu)是A環(huán)和C環(huán)、B環(huán)和C環(huán)2個共軛體系，紫外光對這2個共軛體系的吸收較明顯。黃酮類化合物的紫外光譜圖上主要有2個吸收帶:環(huán)肉桂酰系統(tǒng)引起的吸收帶Ⅰ(300～550nm)和吸收帶Ⅱ(240～280nm)。若檢測過程中加入鋁鹽，則鋁離子與黃酮化合物形成穩(wěn)定的配合物，吸收帶Ⅱ會明顯向長波方向移動，且在NaNO₂強(qiáng)堿作用下，其在510nm處吸光度值最大，這為分光光度法測定黃酮類化合物提供了依據(jù)。“黔中金蕎麥”是貴州省畜牧獸醫(yī)研究所于2019年育成的國審牧草新品種，現(xiàn)已廣泛栽培并應(yīng)用于我省六盤水、大方、黔西、威寧、息烽、貴陽等10余個地區(qū)的生態(tài)畜牧養(yǎng)殖上，并取得一定成效。為檢測黔中金蕎麥植株不同部位的黃酮含量，特開展此項檢測分析試驗，為合理開發(fā)利用該藥飼兼用新型牧草提供科學(xué)依據(jù)。本試驗借鑒郭欣慰等對輻射誘變育成新品種“金蕎1號”(京品鑒藥2012021)利用蘆丁測定其總黃酮的含量，同時參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《蕎麥及其制品中總黃酮的測定》(NY/T1295—2007)，采用NaNO₂－Al(NO₃)₃(亞硝酸鈉－硝酸鋁)比色法進(jìn)行測定。

一、材料與方法

1.1材料

2020年6月采收種植于貴州省畜牧獸醫(yī)研究所麥坪試驗基地的三年生黔中金蕎麥全植株;

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自貴州迪大生物有限公司。

1.2主要試劑及儀器

(1)主要試劑:

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、30%乙醇、亞硝酸鈉(NaNO₂₎、硝酸鋁［Al(NO₃)₃］。

(2)主要儀器:

UV－1800紫外可見分光光度計；

電子天平；

酸度計；

1.3方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020g，置于5mL燒杯中，先用無水乙醇5mL溶解，再用30%乙醇定容至100mL容量瓶中，搖勻，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.20mg/mL。

1.3.2繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

用移液管分別吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1、2、4、6、8、10mL至25mL容量瓶中，用30%乙醇稀釋至10mL(同時作空白對照)，加入5%NaNO₂溶液0.7mL搖勻，立刻加入10%Al(NO₃)₃溶液0.7mL搖勻，放置5min，加入4%NaOH溶液5mL，用30%乙醇定容，混勻后放置5min，即獲得濃度為0.016、0.032、0.064、0.096、0.128、0.160mg/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，并在波長510nm處測定其吸光度值(D510nm)。以濃度為橫坐標(biāo)(x)，吸收度為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.3.3檢測樣品的制備和測定

分別稱取金蕎麥葉、莖、全株、根各100g，在60℃下烘干至恒重，粉碎后過40目篩，準(zhǔn)確稱取各樣品干粉0.3～0.4g置于150mL具塞三角瓶中，加入30%乙醇30mL于65℃恒溫水浴鍋中浸提2h，趁熱用定性濾紙過濾，濾液置于50mL容量瓶中，用30%乙醇清洗濾紙和殘渣，合并濾液用30%乙醇定容，作為待測液。取待測液2mL置于25mL容量瓶中，用30%乙醇稀釋至10mL;加入5%NaNO₂溶液0.7mL搖勻，立刻加入10%Al(NO₃)₃溶液0.7mL搖勻，放置5min;加入4%NaOH溶液5mL，用30%乙醇定容，混勻后放置5min，用紫外分光光度計測定D510nm值(以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品)。

1.3.4加標(biāo)回收方法

已知蘆丁含量的金蕎麥葉、全株、莖、根分別取2份，其中1份分別加入蘆丁標(biāo)

準(zhǔn)品0.016、0.032、0.032、0.032mg。2份同時按1.3.3步驟進(jìn)行檢測分析。

1.3.5結(jié)果計算

各檢測樣品均設(shè)2份平行樣品進(jìn)行測定，要求2份平行樣品測試結(jié)果的絕對差值不大于這2個測試值的算術(shù)平均值的10%，2份平行樣品的算術(shù)平均值作為總黃酮含量的最終結(jié)果。

樣品總黃酮含量(%)=［由標(biāo)準(zhǔn)曲線得試樣濃度(mg/mL)×試樣體積(mL)×稀釋倍數(shù)］÷試樣重量(mg)×100%

回收率(%)=(加標(biāo)試樣測定值－試樣測定值)÷加標(biāo)量×100%

二、結(jié)果與分析

2.1黔中金蕎麥植株不同部位總黃酮含量

由表1可見，利用紫外分光光度計檢測的D510nm值在最佳線性值(0.2～0.7)范圍內(nèi)。黔中金蕎麥植株不同部位總黃酮含量葉＞全株＞莖＞根，分別為10.34%、6.82%、4.36%、2.65%。

2.2總黃酮回收率試驗

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程:y=0.127x-0.0089，Ｒ=1.007，且D510nm值在0.2～0.7范圍內(nèi)，具有較好的線性關(guān)系。對金蕎麥的葉、全株、莖、根樣品分別添加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行回收率試驗分析，測得的D510nm值均在最佳線性值(0.2～0.7)范圍內(nèi)，平均回收率為100.19%，說明本次總黃酮含量的檢測分析結(jié)果較為理想。見表2。

三、討論與結(jié)論

3.1由于天然植物的化學(xué)成分復(fù)雜，用分光光度法進(jìn)行檢測會有許多干擾因素，從而影響檢測結(jié)果，同時在檢測過程中乙醇的濃度、試劑加入時間、顯色時間等因素均可對D510nm值產(chǎn)生較大影響，因此在檢測分析過程中需按要求進(jìn)行實驗操作。

四、文獻(xiàn)出處及鳴謝
本文主要內(nèi)容部分出自：1.亞硝酸鈉－硝酸鋁比色法檢測黔中金蕎麥黃酮含量的分析試驗
中圖分類號:S816.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章編號:1007－1474(2020)06－0009－03
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