和脂肪中的〔多不飽和〕脂肪酸油和脂肪 分光光度法
發(fā)布日期：2017-12-27 點(diǎn)擊次數(shù)：
A 原理
天然共軛化合物可通過在純的溶劑中測定特定波長下的吸收加以檢測。非共軛多不飽和組份可通過在KOH－甘醇溶液中加熱而使其發(fā)生部分共軛，共軛部分的吸收可重新測定。共軛雙烯，三烯，四烯和五烯酸的百分?jǐn)?shù)(%)可通過預(yù)先測定吸光系數(shù)，用解聯(lián)立方程計(jì)算得到。$$此方法可通過五烯酸而測定多不飽和脂肪酸，雙烯酸，對于僅含天然的或順式異物體動物和植物脂肪，僅有小量的成形共軛物質(zhì)，也只有少量色素的吸收在堿性異構(gòu)化時(shí)可以發(fā)生很大的改變。此方法便不適應(yīng)或在特定的條件下才可使用，如氫化油或其它含有反式或不飽和脂肪酸異構(gòu)體的脂肪，類似的魚油或含有比五烯酸更不飽和的酸的脂肪，原油或含有堿性異構(gòu)化時(shí)其吸收值發(fā)生很大變化的色素的樣品，含有大量成形共軛脂肪酸的脂肪或油。
B 儀器
B.a 異構(gòu)化儀器
B.a.1 恒溫浴
180±1℃。其容量應(yīng)可使25×250mm派熱克斯玻璃試管浸入114mm，以B－219石蠟或DC 550液作為浴液。將浴器放在絕熱盒中，其中絕熱盒蓋上應(yīng)有攪拌器和放試管的孔。
B.a.2 試管
派熱克斯玻璃，帶嘴，25×250mm。
B.a.3 分散頭
能與試管配套。分散頭為兩端開口的中空管，且距離底部25和38mm處有兩個(gè)小孔。
B.a.4 多支管
有10個(gè)出口，每個(gè)出口與50mm長口徑為1mm的毛細(xì)管相連接。不用時(shí)應(yīng)蓋住口。
B.a.5 氮?dú)鉁y壓計(jì)
由外徑為6mm的管子彎成高約380mm，寬約30mm的U－型管。用含有1滴甲黃橙和1滴H2SO4的水使測壓計(jì)半充滿。為了調(diào)節(jié)氮?dú)獾牧魉伲捎瞄L約90cm的橡皮管連接到分散頭的出口。將100ml的量筒充滿水并將其倒放在一含有水的容器中。將橡皮管的一端插到量筒中。打開氮?dú)馄浚瑴y定氮?dú)馀懦隽客仓兴乃俣?。此速度?yīng)在50－60ml/min。在測壓計(jì)上標(biāo)明此流速的相應(yīng)液位。
B.b 分光光度計(jì)
波長范圍應(yīng)為220－360nm，最小刻度為0.1nm。當(dāng)光路中無比色皿時(shí)調(diào)節(jié)氫燈，這樣光度計(jì)可在最低可能的波長下進(jìn)行平衡調(diào)節(jié)〔波長通常小于等于211nm〕。在262，268和274nm進(jìn)行吸收測定時(shí)狹縫寬度非常重要，最后平衡調(diào)節(jié)應(yīng)為0.8－0.9mm。
B.c 比色皿
石英、配對的比色皿光程在1.000±0.005cm之內(nèi)，當(dāng)充有水或異辛烷時(shí)，其吸光度應(yīng)在0.01A單位內(nèi)相匹配。
C 試劑
C.a 無水甲醇
光程為1cm時(shí)以水作參比在220nm和測定所用波長范圍檢查甲醇的A值。在220nm時(shí)，其值應(yīng)小于0.4，在262－322nm范圍內(nèi)A的改變曲線應(yīng)光滑。否則按下述方法純化甲醇，重新檢查A值：以新啟桶或玻璃瓶中取2L甲醇于3L雙頸標(biāo)準(zhǔn)磨口蒸餾瓶中；加入10gKOH和25g鋅粉，塞住其中的一個(gè)口，在另一口上接上回流冷凝器，蒸氣浴上回流3h。從蒸氣浴上取下；將回流冷凝器換成蒸餾管，75℃連接管和冷凝器。將燒瓶放在水浴或電熱袍上進(jìn)行蒸餾。用2L的錐形瓶收集餾出液。存放于具塞玻璃瓶中。較高純度的無水甲醇〔如上述所得或經(jīng)純化〕可滿足要求。
C.b 異辛烷〔2，2，4-三甲基戊烷〕
NIST鑒定純或光譜純。符合A值要求的正已烷或環(huán)已烷可滿足要求。可按下述步驟進(jìn)行純化：在80×4.5cm過濾管底部的活塞上端放約9cm的玻璃棉。加入約30cm硅膠〔粒度為12，28－200目，將異辛烷緩慢加入管中，使達(dá)約3/4處。用包有Al箔的軟木塞很松地塞住管的頂端并讓異辛烷從硅膠中濾過，用2L的錐形瓶進(jìn)行收集。為了使異辛烷產(chǎn)生最低限的A值，可及時(shí)更換硅膠。以水作參比，用1cm光程在測試波長范圍檢查異辛烷的A值。在所有波長下，以水的A值為0時(shí)，異辛烷的A值應(yīng)小于等于0.070，且A隨波長的改變曲線為一光滑的曲線。否則要重新過濾且重新進(jìn)行檢查。
C.c KOH-甘醇溶液
6.6%KOH，異構(gòu)化25min。稱取約750g的甘醇到1L圓底派熱克斯玻璃燒瓶中。用裝有短的出口管而進(jìn)口管可到達(dá)燒瓶底部的帶管塞子蓋住燒瓶。將進(jìn)口管與無氧的氮?dú)庠聪噙B接〔氧含量<0.01%〕，在整個(gè)制備過程中向液體中慢慢鼓氮?dú)馐古懦鏊锌諝夂蛿噭右后w。將其放置在100－150℃的油浴中；使油浴升溫到190℃并持續(xù)10min以干燥甘醇。撒除油浴使其溫度降至120℃，在氦氣氛下小心緩慢地向溶液中加入60g 85%的KOH。重新放回油浴，再次加熱油浴到190℃，并持續(xù)此溫度10min之后，從油浴上撒離，冷卻。取下帶有管塞子換上實(shí)心塞子蓋上，氮?dú)夥罩性诩s4℃〔40℉〕冰箱中保存。$$將10.00gKOH－甘醇溶液加到約90ml甲醇中，以酚酞作指示劑用1N的HCl進(jìn)行中和以檢查KOH的含量。用1N的標(biāo)準(zhǔn)HCl進(jìn)行滴定至淺紅色消失。%KOH＝ml×當(dāng)量濃度×5.61/溶液重量。如果%KOH不是6.5－6.6，按上述方法在氮?dú)夥障录訜嶂?90℃使甘醇再干燥一些，調(diào)節(jié)KOH到6.6%。
C.d KOH－甘醇溶液
21%KOH，異構(gòu)化15min。按(c)方法制備，其中85%KOH用量為210g。如需要時(shí)，滴定測量并調(diào)節(jié)KOH的含量為21±0.1%。
C.e 氮?dú)?/b>
預(yù)純化級，氧含量<0.01%。
D 樣品的制備
在蒸氣浴上小心使樣品熔化，充分?jǐn)嚢?，不澄清時(shí)可過濾。
E 測定
(當(dāng)樣品中僅含亞油酸和亞麻酸時(shí)，最好采用6.6%KOH法；當(dāng)樣品含有亞油酸，亞麻酸和花生四烯酸時(shí)，最好采用21%KOH法。當(dāng)樣品含有戊烯酸時(shí)，必需采用21%KOH法〕。
E.a 共軛多不飽和酸
向1ml的派熱克斯玻璃杯〔直徑14mm，高10mm〕中稱取足夠量的樣品使其A值讀數(shù)大于等于0.2〔約200mg〕。將此杯投入含有75ml異辛烷的150ml燒杯中，旋轉(zhuǎn)燒杯使樣品溶解，必要時(shí)可加熱。冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移到100ml的具塞容量瓶中，用溶劑稀釋到刻線，充分混勻。以溶劑作參比在UV區(qū)測定A值，稀釋溶液〔如需要時(shí)和/或采用其它光程的比色皿以使所測A值在0.2－0.8范圍內(nèi)〕。同時(shí)在特定波長的兩邊讀數(shù)，以確定最大A值的存在。如果在特定波長區(qū)無最大值，則可認(rèn)為組份不存在，因此在此范圍可無需進(jìn)行進(jìn)一步計(jì)算。所對應(yīng)的測定波長為：二烯酸，233nm；三烯酸，262，268，274nm；四烯酸，308，315，322nm；五烯酸，346nm。
E.b 非共軛多不飽和脂肪酸，6.6%KOH，異構(gòu)化25min
向1ml的派熱克斯玻璃杯〔直徑14mm，高10mm〕中稱取足夠量的樣品使其A值讀數(shù)大于等于0.2〔約200mg〕。將此杯投入含有75ml異辛烷的150ml燒杯中，旋轉(zhuǎn)燒杯使樣品溶解，必要時(shí)可加熱。冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移到100ml的具塞容量瓶中，用溶劑稀釋到刻線，充分混勻。以溶劑作參比在UV區(qū)測定A值，稀釋溶液〔如需要時(shí)和/或采用其它光程的比色皿以使所測A值在0.2－0.8范圍內(nèi)〕。同時(shí)在特定波長的兩邊讀數(shù)，以確定最大A值的存在。如果在特定波長區(qū)無最大值，則可認(rèn)為組份不存在，因此在此范圍可無需進(jìn)行進(jìn)一步計(jì)算。所對應(yīng)的測定波長為：二烯酸，233nm；三烯酸，262，268，274nm；四烯酸，308，315，322nm；五烯酸，346nm。
E.c 非共軛多不飽和脂肪酸，21%KOH，異構(gòu)化15min
稱取100mg〔精確到0.5mg)樣品到1ml派熱克斯玻璃杯中。稱取11.0±0.1g的6.6%KOH－甘醇溶液到25×250mm派熱克斯玻璃試管中。在樣品測定的同時(shí)做二個(gè)空白對照。用分散頭蓋住試管，將毛細(xì)管與多支管相連。調(diào)節(jié)氮?dú)獾牧髁渴姑糠昼娡ㄟ^試管的氮?dú)饬髁繛榇笥诘扔?0～100ml。讓氮?dú)馔ㄟ^試管1分鐘以除空氣；然后在180±0.1度將試管浸入浴面下114mm處。隨時(shí)檢查溫度，定期校正溫度計(jì)。$$20min后取下分散頭，將裝有樣品的1ml杯子投入試管中，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，更換頭。投入1ml干凈的杯子做為空白。保持分散頭在原處，從浴器中移出試管，劇烈回蕩幾秒鐘，放回浴器；1min后，檢查樣品。如果澄清則放回浴器；否則表明皂化不完全，將試管回蕩2－3次后放回浴器。每隔1min重復(fù)回蕩直到皂化完全。保持浴器溫度在180±1℃。$$在將樣品投入試管中整好25min后，從浴器中取出，擦干凈后放入3L燒杯中冷卻，繼續(xù)在溶液上面通氮?dú)?。也可用冷水浴。冷卻后取掉頭，用20ml經(jīng)純化的甲醇洗滌管子下部，收集洗滌液于試管中。用燒杯中的甲醇洗滌，不要用洗瓶。$$將一端彎曲的長30cm的玻璃攪拌棒插入到試管的底部，上下來回移動杯子以混合溶液。將此溶液轉(zhuǎn)移到100ml的具塞容量瓶中，用經(jīng)純化的甲醇稀釋到刻線，充分混勻。以KOH－甘醇空白作參比按(a)測定A值。如果樣品需要稀釋時(shí)，也應(yīng)對參比做同樣的稀釋。如果不檢測空白，應(yīng)重復(fù)測定數(shù)次，增加氮?dú)饬髁俊?nbsp;
F 分光光度讀數(shù)
如果已知樣品中不含多不飽和脂肪酸，或在測試中已確證其不存在〔在分析波長下無最大值〕，則在此吸收范圍內(nèi)無需有分光光度讀數(shù)，此范圍內(nèi)計(jì)算式中不需要a值。例如，已知棉籽中不含有比二烯酸〔亞油酸〕具有更大不飽和度的多不飽和組份，因此，在分析此油時(shí)，只需在233nm進(jìn)行測定，且計(jì)算亞油酸含量的方法中僅需在此濾長下的α值。$$只有在測定非常少量脂肪酸時(shí)，才需對背景吸收進(jìn)行校正。如果脂肪酸的含量較多時(shí)，無需進(jìn)行背景校正，且校正可能會得出錯(cuò)誤的結(jié)果。在分析波長下，當(dāng)多不飽和組份在異構(gòu)化后的α值>1.0時(shí)，無需進(jìn)行背景校正。在用21%KOH進(jìn)行異構(gòu)化后，無需對背景進(jìn)行校正。
F.a 共軛組份的吸光系數(shù)
計(jì)算每一測定波長下的α值，E(a)，用233，268，315，346下角注以標(biāo)明所對應(yīng)的每個(gè)α值。$$吸收系數(shù)α＝A/bc，式中A為所測的吸光度，b為比色皿光程〔cm〕，c為在測A時(shí)的樣品最終稀釋度，g樣品/L。$$以下帶有2，3，4和5下標(biāo)注的計(jì)算式，分別對應(yīng)于二烯，三烯，四烯和五烯的組份。$$在233nm處經(jīng)酸或酯基吸收校正的吸收系數(shù)二α2＝α233－α0，式中α0對于酯，其值為0.07，對于皂和脂肪酸，其值為0.03。$$在268nm處經(jīng)背景吸收校正后的吸收系數(shù)＝α3＝2.8[α268－1/2(α262+α274)]。$$在315nm處經(jīng)背景吸收校正后的吸收系數(shù)＝α4＝2.5[α315－1/2(α308+α322)]。$$在346nm處的吸收系數(shù)＝α5＝α346。
F.b 共軛酸
如果在α3或α4括號中的值為0或負(fù)值，則表明沒有最大特征吸收，認(rèn)為所對應(yīng)的組份不存在。由于前體組份通常含量較少，因此需要進(jìn)行背景吸收校正。如果前體組份大量存在時(shí)，此方法則不適應(yīng)。然而，在戊烯區(qū)，346nm，讀數(shù)可不需進(jìn)行背景校正。$$%共軛二烯＝C2＝0.91α2$$%共軛三烯＝C3＝0.47α3$$%共軛四烯＝C4＝0.45α4$$%共扼戊烯＝C5＝0.39α5
F.c 非共軛組份吸收系數(shù)，6.6%KOH，異構(gòu)化25min
在每一測定波長下計(jì)算α'值，(b)，α'＝A/bc。$$經(jīng)對原來存在的共軛二烯酸進(jìn)行校正后，在233nm處的吸收系數(shù)＝α'2＝α'233－α2－0.03。$$經(jīng)對背景吸收及未被破壞的共軛三烯進(jìn)行校正后在268nm處的吸收系數(shù)＝α'3＝4.03[α'268－1/2(α'262+α'274)]－α3。$$經(jīng)對背景吸收及未被破壞的共軛四烯進(jìn)行校正后在315nm處的吸收系數(shù)＝α'4＝2.06[α'315－1/2(α'308+α'322)]－α4。
F.d 非共軛酸，6.6%KOH，異構(gòu)化25min
F.d.1 未經(jīng)背景校正：
%亞油酸＝X＝1.086α'2－1.324(α'268－α268)+0.40(α'315－α315)$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.980(α'268－α268)－4.92(α'315－α315)$$%花生四烯酸＝Z＝4.69(α'315－α315)
F.d.2 當(dāng)需要進(jìn)行背景校正時(shí)：
%亞油酸＝X＝1.086α'2－1.324α'3+0.40α'4$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.980α'3－4.92α'4$$%花生四烯酸＝Z＝4.69α'4
F.e 非共軛組份的吸收系數(shù)，21%的KOH，異構(gòu)化15min
計(jì)算233，268，315和346nm下每一波長的α'值。〔如果無最大值，無需進(jìn)行進(jìn)一步測定或計(jì)算，報(bào)告組份含量為0〕。$$在233nm處的吸收系數(shù)＝α'2＝α'233－α2$$在268nm處的吸收系數(shù)＝α'3＝α'268－α268$$在315nm處的吸收系數(shù)＝α'4＝α'315－α315$$在346nm處的吸收系數(shù)＝α'5＝α'346－α346
F.f 非共軛酸，21%的KOH，異構(gòu)化15min
〔分光光度法將不能區(qū)分不同鏈長具有相同數(shù)目雙鍵的酸，如不能區(qū)分C20和C22戊烯酸。下列計(jì)算式中的前兩組分別適用于含有C20戊烯酸的樣品和含有C22戊烯酸的樣品。如果不知道鏈長，假設(shè)這些戊烯酸的含量相等，則采用第三組計(jì)算式〕
F.f.1 含有C20戊烯酸的樣品：
%亞油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4+0.002α'5$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.10α'3－0.88α'4+0.31α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.55α'5$$%戊烯酸＝P＝1.14α'5
F.f.2 含有C22戊烯酸的樣品：
%亞油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4－0.12α'5$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.10α'3－0.88α'4－0.02α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.86α'5$$%戊烯酸＝P＝1.98α'5
F.f.3 含未知鏈長戊烯酸的樣品〔按50%C20－50%C22戊烯酸計(jì)算〕：
%亞油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4－0.03α'5$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.10α'3－0.88α'4+0.19α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.67α'5$$%戊烯酸＝P＝1.45α'5
F.g 總組成：
%總共軛多不飽和酸＝C2+C3+C4+C5$$%總非共軛多不飽和酸＝X+Y+Z+P$$%油酸＝{樣品的碘值(wijs)－[1.811(C2+X)+2.737(C3+Y)+3.337(C4+Z)+ 4.014(C5+P)]}/0.899$$%飽和酸＝%總脂肪酸－(%油酸+%共軛酸+%非共軛酸)$$〔許多天然油的%總脂肪酸為95.6。將%值乘以100/%總脂肪酸即為脂肪酸組份〕。
G 計(jì)算
天然共軛化合物可通過在純的溶劑中測定特定波長下的吸收加以檢測。非共軛多不飽和組份可通過在KOH－甘醇溶液中加熱而使其發(fā)生部分共軛，共軛部分的吸收可重新測定。共軛雙烯，三烯，四烯和五烯酸的百分?jǐn)?shù)(%)可通過預(yù)先測定吸光系數(shù)，用解聯(lián)立方程計(jì)算得到。$$此方法可通過五烯酸而測定多不飽和脂肪酸，雙烯酸，對于僅含天然的或順式異物體動物和植物脂肪，僅有小量的成形共軛物質(zhì)，也只有少量色素的吸收在堿性異構(gòu)化時(shí)可以發(fā)生很大的改變。此方法便不適應(yīng)或在特定的條件下才可使用，如氫化油或其它含有反式或不飽和脂肪酸異構(gòu)體的脂肪，類似的魚油或含有比五烯酸更不飽和的酸的脂肪，原油或含有堿性異構(gòu)化時(shí)其吸收值發(fā)生很大變化的色素的樣品，含有大量成形共軛脂肪酸的脂肪或油。
B 儀器
B.a 異構(gòu)化儀器
B.a.1 恒溫浴
180±1℃。其容量應(yīng)可使25×250mm派熱克斯玻璃試管浸入114mm，以B－219石蠟或DC 550液作為浴液。將浴器放在絕熱盒中，其中絕熱盒蓋上應(yīng)有攪拌器和放試管的孔。
B.a.2 試管
派熱克斯玻璃，帶嘴，25×250mm。
B.a.3 分散頭
能與試管配套。分散頭為兩端開口的中空管，且距離底部25和38mm處有兩個(gè)小孔。
B.a.4 多支管
有10個(gè)出口，每個(gè)出口與50mm長口徑為1mm的毛細(xì)管相連接。不用時(shí)應(yīng)蓋住口。
B.a.5 氮?dú)鉁y壓計(jì)
由外徑為6mm的管子彎成高約380mm，寬約30mm的U－型管。用含有1滴甲黃橙和1滴H2SO4的水使測壓計(jì)半充滿。為了調(diào)節(jié)氮?dú)獾牧魉伲捎瞄L約90cm的橡皮管連接到分散頭的出口。將100ml的量筒充滿水并將其倒放在一含有水的容器中。將橡皮管的一端插到量筒中。打開氮?dú)馄浚瑴y定氮?dú)馀懦隽客仓兴乃俣?。此速度?yīng)在50－60ml/min。在測壓計(jì)上標(biāo)明此流速的相應(yīng)液位。
B.b 分光光度計(jì)
波長范圍應(yīng)為220－360nm，最小刻度為0.1nm。當(dāng)光路中無比色皿時(shí)調(diào)節(jié)氫燈，這樣光度計(jì)可在最低可能的波長下進(jìn)行平衡調(diào)節(jié)〔波長通常小于等于211nm〕。在262，268和274nm進(jìn)行吸收測定時(shí)狹縫寬度非常重要，最后平衡調(diào)節(jié)應(yīng)為0.8－0.9mm。
B.c 比色皿
石英、配對的比色皿光程在1.000±0.005cm之內(nèi)，當(dāng)充有水或異辛烷時(shí)，其吸光度應(yīng)在0.01A單位內(nèi)相匹配。
C 試劑
C.a 無水甲醇
光程為1cm時(shí)以水作參比在220nm和測定所用波長范圍檢查甲醇的A值。在220nm時(shí)，其值應(yīng)小于0.4，在262－322nm范圍內(nèi)A的改變曲線應(yīng)光滑。否則按下述方法純化甲醇，重新檢查A值：以新啟桶或玻璃瓶中取2L甲醇于3L雙頸標(biāo)準(zhǔn)磨口蒸餾瓶中；加入10gKOH和25g鋅粉，塞住其中的一個(gè)口，在另一口上接上回流冷凝器，蒸氣浴上回流3h。從蒸氣浴上取下；將回流冷凝器換成蒸餾管，75℃連接管和冷凝器。將燒瓶放在水浴或電熱袍上進(jìn)行蒸餾。用2L的錐形瓶收集餾出液。存放于具塞玻璃瓶中。較高純度的無水甲醇〔如上述所得或經(jīng)純化〕可滿足要求。
C.b 異辛烷〔2，2，4-三甲基戊烷〕
NIST鑒定純或光譜純。符合A值要求的正已烷或環(huán)已烷可滿足要求。可按下述步驟進(jìn)行純化：在80×4.5cm過濾管底部的活塞上端放約9cm的玻璃棉。加入約30cm硅膠〔粒度為12，28－200目，將異辛烷緩慢加入管中，使達(dá)約3/4處。用包有Al箔的軟木塞很松地塞住管的頂端并讓異辛烷從硅膠中濾過，用2L的錐形瓶進(jìn)行收集。為了使異辛烷產(chǎn)生最低限的A值，可及時(shí)更換硅膠。以水作參比，用1cm光程在測試波長范圍檢查異辛烷的A值。在所有波長下，以水的A值為0時(shí)，異辛烷的A值應(yīng)小于等于0.070，且A隨波長的改變曲線為一光滑的曲線。否則要重新過濾且重新進(jìn)行檢查。
C.c KOH-甘醇溶液
6.6%KOH，異構(gòu)化25min。稱取約750g的甘醇到1L圓底派熱克斯玻璃燒瓶中。用裝有短的出口管而進(jìn)口管可到達(dá)燒瓶底部的帶管塞子蓋住燒瓶。將進(jìn)口管與無氧的氮?dú)庠聪噙B接〔氧含量<0.01%〕，在整個(gè)制備過程中向液體中慢慢鼓氮?dú)馐古懦鏊锌諝夂蛿噭右后w。將其放置在100－150℃的油浴中；使油浴升溫到190℃并持續(xù)10min以干燥甘醇。撒除油浴使其溫度降至120℃，在氦氣氛下小心緩慢地向溶液中加入60g 85%的KOH。重新放回油浴，再次加熱油浴到190℃，并持續(xù)此溫度10min之后，從油浴上撒離，冷卻。取下帶有管塞子換上實(shí)心塞子蓋上，氮?dú)夥罩性诩s4℃〔40℉〕冰箱中保存。$$將10.00gKOH－甘醇溶液加到約90ml甲醇中，以酚酞作指示劑用1N的HCl進(jìn)行中和以檢查KOH的含量。用1N的標(biāo)準(zhǔn)HCl進(jìn)行滴定至淺紅色消失。%KOH＝ml×當(dāng)量濃度×5.61/溶液重量。如果%KOH不是6.5－6.6，按上述方法在氮?dú)夥障录訜嶂?90℃使甘醇再干燥一些，調(diào)節(jié)KOH到6.6%。
C.d KOH－甘醇溶液
21%KOH，異構(gòu)化15min。按(c)方法制備，其中85%KOH用量為210g。如需要時(shí)，滴定測量并調(diào)節(jié)KOH的含量為21±0.1%。
C.e 氮?dú)?/b>
預(yù)純化級，氧含量<0.01%。
D 樣品的制備
在蒸氣浴上小心使樣品熔化，充分?jǐn)嚢?，不澄清時(shí)可過濾。
E 測定
(當(dāng)樣品中僅含亞油酸和亞麻酸時(shí)，最好采用6.6%KOH法；當(dāng)樣品含有亞油酸，亞麻酸和花生四烯酸時(shí)，最好采用21%KOH法。當(dāng)樣品含有戊烯酸時(shí)，必需采用21%KOH法〕。
E.a 共軛多不飽和酸
向1ml的派熱克斯玻璃杯〔直徑14mm，高10mm〕中稱取足夠量的樣品使其A值讀數(shù)大于等于0.2〔約200mg〕。將此杯投入含有75ml異辛烷的150ml燒杯中，旋轉(zhuǎn)燒杯使樣品溶解，必要時(shí)可加熱。冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移到100ml的具塞容量瓶中，用溶劑稀釋到刻線，充分混勻。以溶劑作參比在UV區(qū)測定A值，稀釋溶液〔如需要時(shí)和/或采用其它光程的比色皿以使所測A值在0.2－0.8范圍內(nèi)〕。同時(shí)在特定波長的兩邊讀數(shù)，以確定最大A值的存在。如果在特定波長區(qū)無最大值，則可認(rèn)為組份不存在，因此在此范圍可無需進(jìn)行進(jìn)一步計(jì)算。所對應(yīng)的測定波長為：二烯酸，233nm；三烯酸，262，268，274nm；四烯酸，308，315，322nm；五烯酸，346nm。
E.b 非共軛多不飽和脂肪酸，6.6%KOH，異構(gòu)化25min
向1ml的派熱克斯玻璃杯〔直徑14mm，高10mm〕中稱取足夠量的樣品使其A值讀數(shù)大于等于0.2〔約200mg〕。將此杯投入含有75ml異辛烷的150ml燒杯中，旋轉(zhuǎn)燒杯使樣品溶解，必要時(shí)可加熱。冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移到100ml的具塞容量瓶中，用溶劑稀釋到刻線，充分混勻。以溶劑作參比在UV區(qū)測定A值，稀釋溶液〔如需要時(shí)和/或采用其它光程的比色皿以使所測A值在0.2－0.8范圍內(nèi)〕。同時(shí)在特定波長的兩邊讀數(shù)，以確定最大A值的存在。如果在特定波長區(qū)無最大值，則可認(rèn)為組份不存在，因此在此范圍可無需進(jìn)行進(jìn)一步計(jì)算。所對應(yīng)的測定波長為：二烯酸，233nm；三烯酸，262，268，274nm；四烯酸，308，315，322nm；五烯酸，346nm。
E.c 非共軛多不飽和脂肪酸，21%KOH，異構(gòu)化15min
稱取100mg〔精確到0.5mg)樣品到1ml派熱克斯玻璃杯中。稱取11.0±0.1g的6.6%KOH－甘醇溶液到25×250mm派熱克斯玻璃試管中。在樣品測定的同時(shí)做二個(gè)空白對照。用分散頭蓋住試管，將毛細(xì)管與多支管相連。調(diào)節(jié)氮?dú)獾牧髁渴姑糠昼娡ㄟ^試管的氮?dú)饬髁繛榇笥诘扔?0～100ml。讓氮?dú)馔ㄟ^試管1分鐘以除空氣；然后在180±0.1度將試管浸入浴面下114mm處。隨時(shí)檢查溫度，定期校正溫度計(jì)。$$20min后取下分散頭，將裝有樣品的1ml杯子投入試管中，準(zhǔn)確記錄時(shí)間，更換頭。投入1ml干凈的杯子做為空白。保持分散頭在原處，從浴器中移出試管，劇烈回蕩幾秒鐘，放回浴器；1min后，檢查樣品。如果澄清則放回浴器；否則表明皂化不完全，將試管回蕩2－3次后放回浴器。每隔1min重復(fù)回蕩直到皂化完全。保持浴器溫度在180±1℃。$$在將樣品投入試管中整好25min后，從浴器中取出，擦干凈后放入3L燒杯中冷卻，繼續(xù)在溶液上面通氮?dú)?。也可用冷水浴。冷卻后取掉頭，用20ml經(jīng)純化的甲醇洗滌管子下部，收集洗滌液于試管中。用燒杯中的甲醇洗滌，不要用洗瓶。$$將一端彎曲的長30cm的玻璃攪拌棒插入到試管的底部，上下來回移動杯子以混合溶液。將此溶液轉(zhuǎn)移到100ml的具塞容量瓶中，用經(jīng)純化的甲醇稀釋到刻線，充分混勻。以KOH－甘醇空白作參比按(a)測定A值。如果樣品需要稀釋時(shí)，也應(yīng)對參比做同樣的稀釋。如果不檢測空白，應(yīng)重復(fù)測定數(shù)次，增加氮?dú)饬髁俊?nbsp;
F 分光光度讀數(shù)
如果已知樣品中不含多不飽和脂肪酸，或在測試中已確證其不存在〔在分析波長下無最大值〕，則在此吸收范圍內(nèi)無需有分光光度讀數(shù)，此范圍內(nèi)計(jì)算式中不需要a值。例如，已知棉籽中不含有比二烯酸〔亞油酸〕具有更大不飽和度的多不飽和組份，因此，在分析此油時(shí)，只需在233nm進(jìn)行測定，且計(jì)算亞油酸含量的方法中僅需在此濾長下的α值。$$只有在測定非常少量脂肪酸時(shí)，才需對背景吸收進(jìn)行校正。如果脂肪酸的含量較多時(shí)，無需進(jìn)行背景校正，且校正可能會得出錯(cuò)誤的結(jié)果。在分析波長下，當(dāng)多不飽和組份在異構(gòu)化后的α值>1.0時(shí)，無需進(jìn)行背景校正。在用21%KOH進(jìn)行異構(gòu)化后，無需對背景進(jìn)行校正。
F.a 共軛組份的吸光系數(shù)
計(jì)算每一測定波長下的α值，E(a)，用233，268，315，346下角注以標(biāo)明所對應(yīng)的每個(gè)α值。$$吸收系數(shù)α＝A/bc，式中A為所測的吸光度，b為比色皿光程〔cm〕，c為在測A時(shí)的樣品最終稀釋度，g樣品/L。$$以下帶有2，3，4和5下標(biāo)注的計(jì)算式，分別對應(yīng)于二烯，三烯，四烯和五烯的組份。$$在233nm處經(jīng)酸或酯基吸收校正的吸收系數(shù)二α2＝α233－α0，式中α0對于酯，其值為0.07，對于皂和脂肪酸，其值為0.03。$$在268nm處經(jīng)背景吸收校正后的吸收系數(shù)＝α3＝2.8[α268－1/2(α262+α274)]。$$在315nm處經(jīng)背景吸收校正后的吸收系數(shù)＝α4＝2.5[α315－1/2(α308+α322)]。$$在346nm處的吸收系數(shù)＝α5＝α346。
F.b 共軛酸
如果在α3或α4括號中的值為0或負(fù)值，則表明沒有最大特征吸收，認(rèn)為所對應(yīng)的組份不存在。由于前體組份通常含量較少，因此需要進(jìn)行背景吸收校正。如果前體組份大量存在時(shí)，此方法則不適應(yīng)。然而，在戊烯區(qū)，346nm，讀數(shù)可不需進(jìn)行背景校正。$$%共軛二烯＝C2＝0.91α2$$%共軛三烯＝C3＝0.47α3$$%共軛四烯＝C4＝0.45α4$$%共扼戊烯＝C5＝0.39α5
F.c 非共軛組份吸收系數(shù)，6.6%KOH，異構(gòu)化25min
在每一測定波長下計(jì)算α'值，(b)，α'＝A/bc。$$經(jīng)對原來存在的共軛二烯酸進(jìn)行校正后，在233nm處的吸收系數(shù)＝α'2＝α'233－α2－0.03。$$經(jīng)對背景吸收及未被破壞的共軛三烯進(jìn)行校正后在268nm處的吸收系數(shù)＝α'3＝4.03[α'268－1/2(α'262+α'274)]－α3。$$經(jīng)對背景吸收及未被破壞的共軛四烯進(jìn)行校正后在315nm處的吸收系數(shù)＝α'4＝2.06[α'315－1/2(α'308+α'322)]－α4。
F.d 非共軛酸，6.6%KOH，異構(gòu)化25min
F.d.1 未經(jīng)背景校正：
%亞油酸＝X＝1.086α'2－1.324(α'268－α268)+0.40(α'315－α315)$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.980(α'268－α268)－4.92(α'315－α315)$$%花生四烯酸＝Z＝4.69(α'315－α315)
F.d.2 當(dāng)需要進(jìn)行背景校正時(shí)：
%亞油酸＝X＝1.086α'2－1.324α'3+0.40α'4$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.980α'3－4.92α'4$$%花生四烯酸＝Z＝4.69α'4
F.e 非共軛組份的吸收系數(shù)，21%的KOH，異構(gòu)化15min
計(jì)算233，268，315和346nm下每一波長的α'值。〔如果無最大值，無需進(jìn)行進(jìn)一步測定或計(jì)算，報(bào)告組份含量為0〕。$$在233nm處的吸收系數(shù)＝α'2＝α'233－α2$$在268nm處的吸收系數(shù)＝α'3＝α'268－α268$$在315nm處的吸收系數(shù)＝α'4＝α'315－α315$$在346nm處的吸收系數(shù)＝α'5＝α'346－α346
F.f 非共軛酸，21%的KOH，異構(gòu)化15min
〔分光光度法將不能區(qū)分不同鏈長具有相同數(shù)目雙鍵的酸，如不能區(qū)分C20和C22戊烯酸。下列計(jì)算式中的前兩組分別適用于含有C20戊烯酸的樣品和含有C22戊烯酸的樣品。如果不知道鏈長，假設(shè)這些戊烯酸的含量相等，則采用第三組計(jì)算式〕
F.f.1 含有C20戊烯酸的樣品：
%亞油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4+0.002α'5$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.10α'3－0.88α'4+0.31α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.55α'5$$%戊烯酸＝P＝1.14α'5
F.f.2 含有C22戊烯酸的樣品：
%亞油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4－0.12α'5$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.10α'3－0.88α'4－0.02α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.86α'5$$%戊烯酸＝P＝1.98α'5
F.f.3 含未知鏈長戊烯酸的樣品〔按50%C20－50%C22戊烯酸計(jì)算〕：
%亞油酸＝X＝1.09α'2－0.57α'3－0.26α'4－0.03α'5$$%亞麻酸＝Y(jié)＝1.10α'3－0.88α'4+0.19α'5$$%花生四烯酸＝Z＝1.65α'4－1.67α'5$$%戊烯酸＝P＝1.45α'5
F.g 總組成：
%總共軛多不飽和酸＝C2+C3+C4+C5$$%總非共軛多不飽和酸＝X+Y+Z+P$$%油酸＝{樣品的碘值(wijs)－[1.811(C2+X)+2.737(C3+Y)+3.337(C4+Z)+ 4.014(C5+P)]}/0.899$$%飽和酸＝%總脂肪酸－(%油酸+%共軛酸+%非共軛酸)$$〔許多天然油的%總脂肪酸為95.6。將%值乘以100/%總脂肪酸即為脂肪酸組份〕。
G 計(jì)算
