差示分光光度法測(cè)定藥物制劑中的四環(huán)素

四環(huán)素是生物合成的廣譜抗菌素。臨床研究表明，病人服用四環(huán)素后，定時(shí)測(cè)定體液中四環(huán)素含量可診斷胃癌，四環(huán)素還可作為熒光探針用以診斷癌癥。近年來(lái)，四環(huán)素還廣泛被用作飼料添加劑，以增強(qiáng)動(dòng)物的抗病能力。關(guān)于四環(huán)素的測(cè)定方法，已有許多報(bào)道，如微生物法、分光光度法差示導(dǎo)數(shù)光譜法、FIA、RHPL、ISE、吸附SV、三氯化鐵比色法等。本文利用四環(huán)素與鉆離子在PH為11.5的Na₂HPO₄－NaOH緩沖溶液中生成黃綠色絡(luò)合物，并根據(jù)其光譜變化的牲性，采用差示光度法不經(jīng)分離直接測(cè)定了藥物制劑中的四環(huán)素。四環(huán)素濃度在0.80－25ug/ml范圍內(nèi)符合比耳定律。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

美析儀器v-1500分光光度計(jì)；PH－HJ908OB數(shù)字酸度計(jì)時(shí)北京海淀航天計(jì)算機(jī)公司）；XYJ80－2離心沉淀機(jī)（江蘇醫(yī)療器械廠）。

鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液：用標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所提供）配成2mg／ml的儲(chǔ)備液，使用時(shí)用水稀釋成0.2mg／ml；鉆離子溶液：用CoCl₂·6H₂O配成1mg／ml的儲(chǔ)備液，使用時(shí)稀釋成0.1mg／ml；Na₂HPO₄－NaOH緩沖溶液。以上試劑均為分析純，水為市售二次去離子水。

1.2  實(shí)驗(yàn)方法

于兩支25ml的比色管中，分別加入0.2mg／ml的鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用液2.0ml，一支用水稀釋至刻度作參比液，另一支加入0.1mg／ml的鈷離子溶液2ml，Na₂HPO₄－NaOH緩沖2ml，用水稀釋至刻度。前者置參比池中，后者置樣品池中，于405nm處測(cè)其吸光度。

2  結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

絡(luò)合物的形成受諸多因素的影響，本文對(duì)酸度，緩沖溶液的種類(lèi)及用量、鈷離子的用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等條件的影響作了討論。

2.1.1  吸收光譜  將鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)使用液按實(shí)驗(yàn)方法處理后，在380－500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描。鹽酸四環(huán)素在405nm處最大吸收，可作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2  酸度對(duì)絡(luò)合物形成的影響   溶液的酸度對(duì)四環(huán)素與鈷離子生成絡(luò)合物影響較大。對(duì)不同酸度條件下絡(luò)合物的形成進(jìn)行了研究，在酸性、中性介質(zhì)中，絡(luò)合物不易形成。隨著溶液PH值的升高，溶液顏色逐漸加深，吸光度逐漸增大。PH在10.5－13.0范圍內(nèi)吸光度最大且穩(wěn)定；當(dāng)PH>13.0，絡(luò)合物的吸光度開(kāi)始減小，這說(shuō)明絡(luò)合物在強(qiáng)堿性介質(zhì)中開(kāi)始離解，PH值越大，離解越歷害。這是由于大量的OH－和鈷離子形成了Co(OH)的絡(luò)離子，促使四環(huán)素一鈷離子絡(luò)合物離解。故本實(shí)驗(yàn)選擇pH11.5?！?

2.1.3  緩沖溶液種類(lèi)及用量

緩沖溶液的種類(lèi)及用量對(duì)絡(luò)合物的形成有一定的影響。在Na₂HPO₄－NaOH，H₃PO₄－檸檬酸－NaOH，NaOH等不同的緩沖體系中，以在Na₂HPO₄－NaOH緩沖液中絡(luò)合物的吸光度最大且穩(wěn)定，用量以控制在2ml最為合適，用量太小不利于絡(luò)合物的形成，太大形成的絡(luò)合物又開(kāi)始離解。在H₃PO₄－檸檬酸－NaOH緩沖液中，由于檸檬酸對(duì)Co²⁺有較強(qiáng)的絡(luò)合能力，消弱了Co²⁺與四環(huán)素的絡(luò)合。故本實(shí)驗(yàn)選擇Na₂HPO₄－NaOH作為緩沖溶液。

2.1.4  鈷離子用量的影響  在Na₂HPO₄－NaOH緩沖液中，足夠量的Co²⁺對(duì)對(duì)絡(luò)合物的形成是必要的，隨鈷離子用量的增加，絡(luò)合物的吸光度了相就增加。鈷離子用量在1.5－3.0ml范圍內(nèi)，吸光度值最大且穩(wěn)定。故本驗(yàn)選擇鈷離子的用量為2ml。

2.1.5 溫度及時(shí)間對(duì)形成絡(luò)合物的影響  溫度升高，吸光度略有減小，同時(shí)，隨溫度升高，絡(luò)合物的最大吸收波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生紅移，故本研究選擇在室溫（20℃）下進(jìn)行。另外，實(shí)驗(yàn)還表明，絡(luò)合物的形成速度比較快，按實(shí)驗(yàn)方法加入試劑后（約需10min），立刻進(jìn)行時(shí)間掃描，發(fā)現(xiàn)1h內(nèi)絡(luò)合物的吸光度值的變化僅為0.005，24h內(nèi)吸光度值無(wú)顯著變化，說(shuō)明生成的絡(luò)合物很穩(wěn)定。

2.1.6  線性范圍  在12支25ml的比色管中，依次加入 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0，2.5ml鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)工作液各兩份，其余按實(shí)驗(yàn)方法處理后測(cè)定，所得結(jié)果線性處理后，線性回歸方程為：A＝－0.0095＋0.0305c（c為四環(huán)素的濃度：ug／ml），相關(guān)系數(shù)r＝0.9997，

ε＝1.33×10₄L·mol^－1·cm^－1。

根據(jù)IUPAC規(guī)定，計(jì)算得檢出限為0.40ug／ml，結(jié)果表明四環(huán)素濃度在0.80－

25ug／ml范圍內(nèi)符合比耳定律。

2.2  干擾性實(shí)驗(yàn)

四環(huán)素制劑中加有淀粉、滑石粉、糊精、葡萄糖、硬脂酸鎂等賦形劑。按實(shí)驗(yàn)方法作同樣處理，所有賦形劑的差示光譜在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)吸收。因此，可以不用任何分離直接測(cè)定片劑中四環(huán)素的含量。

2.3   回收率測(cè)定

精密稱(chēng)取適量已知含量的樣品，加入一定量的鹽酸四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品，按實(shí)驗(yàn)方法處理，用測(cè)得的吸光度值減去樣品的吸光度，用線性回歸方程計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表1。

表  1  回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 樣品的測(cè)定

精密稱(chēng)取四環(huán)素片10片，分別研成粉末，再適量稱(chēng)取，按前述實(shí)驗(yàn)方法處理測(cè)定，用回歸方程計(jì)算其含量，結(jié)果見(jiàn)表2。本法較紫外法結(jié)果略偏低，經(jīng)t檢驗(yàn)，本法與紫外法間并無(wú)系統(tǒng)誤差。

表2 樣品中四環(huán)素的測(cè)定