分光光度法測葉綠素
發(fā)布日期：2017-08-14 點擊次數：
一、實驗目的
1.了解植物組織中葉綠素的分布及性質。
2.掌握測定葉綠素含量的原理和方法。
二、實驗原理
葉綠素廣泛存在于果蔬等綠色植物組織中，并在植物細胞中與蛋白質結合成葉綠體。當植物細胞死亡后，葉綠素即游離出來，游離葉綠素很不穩(wěn)定，對光、熱較敏感；在酸性條件下葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，在稀堿液中可水解成鮮綠色的葉綠酸鹽以及葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種：葉綠素a 和b，兩者均易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。
葉綠素的含量測定方法有多種，其中主要有：
1.原子吸收光譜法：通過測定鎂元素的含量，進而間接計算葉綠素的含量。
2.分光光度法：利用分光光度計測定葉綠素提取液在最大吸收波長下的吸光值，即可用朗伯—比爾定律計算出提取液中各色素的含量。
葉綠素a 和葉綠素b 在645nm 和663nm 處有最大吸收，且兩吸收曲線相交于652nm 處。因此測定
提取液在645nm、663nm、652nm 波長下的吸光值，并根據經驗公式可分別計算出葉綠素a、葉綠素b
和總葉綠素的含量。
三、儀器、原料和試劑
儀器
分光光度計、電子頂載天平(感量0．01g)、研缽、棕色容量瓶、小漏斗、定量濾紙、吸水紙、擦境紙、滴管。
原料
新鮮(或烘干)的植物葉片
試劑
1. 96％乙醇(或80％丙酮)
2. 石英砂
3. 碳酸鈣粉
四、操作步驟
取新鮮植物葉片(或其它綠色組織)或干材料，擦凈組織表面污物，去除中脈剪碎。稱取剪碎的新鮮樣品2g，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及3mL95％乙醇，研成均漿，再加乙醇10mL，繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3～5min。
取濾紙1張置于漏斗中，用乙醇濕潤，沿玻棒把提取液倒入漏斗，濾液流至100mL 棕色容量瓶中；用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中。
用滴管吸取乙醇，將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘渣中無綠色為止。最后用乙醇定容至100mL，搖勻。
取葉綠體色素提取液在波長665nm、645nm 和652nm 下測定吸光度，以95％乙醇為空白對照。
五、計算
按照實驗原理中提供的經驗公式，分別計算植物材料中葉綠素a、b 和總葉綠素的含量
葉綠體色素的提取、分離、理化性質及含量測定
[ 實驗原理 ]
植物葉綠體色素是吸收太陽光能，進行光合作用的重要物質。它一般由葉綠素 a 、葉綠素 b 、胡蘿卜素和葉黃素組成。這些色素都不溶于水，而溶于有機溶劑，故可用乙醇、丙酮等有機溶劑提取。
色素分離的方法有多種，紙層析是最簡便的一種。當溶劑（有機推動劑）不斷從紙上流過時，由于混合物（葉綠素提取液）中各種成分在固定相（濾紙纖維素所吸附的水分）和流動相（有機推動劑）間具有不同的分配系數，所以移動速度不同，經過一定時間后，可將各種色素分開。
葉綠素是一種二羧酸——葉綠酸與甲醇和葉綠醇形成的復雜酯，故可與堿起皂化反應而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產生的鹽能溶于水中，可用此法將葉綠素與類胡蘿卜素分開。
葉綠素與類胡蘿卜素都具有光學活性，表現出一定的吸收光譜，可用分光光度計精確測定。葉綠素吸收光量子而轉變成激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的葉綠素分子很不穩(wěn)定，當它變回到基態(tài)時可發(fā)射出紅光量子，因而產生熒光。葉綠素的化學性質很不穩(wěn)定，容易受強光的破壞，特別是當葉綠素與蛋白質分離以后，破壞更快，而類胡蘿卜素則較穩(wěn)定。葉綠素中的鎂可以被氫離子所取代而成褐色的去鎂葉綠素。去鎂葉綠素遇銅則成為銅代葉綠素，銅代葉綠素很穩(wěn)定，在光下不易破壞，故常用此法制作綠色多汁植物的浸漬標本。
根據朗伯一比爾定律，某有色溶液的吸光度 D 與其中溶液濃度 C 和液層厚度 L 成正比，即：
D ＝ KCL
D ：吸光度，即吸收光的量， C ：溶液濃度 ,
K ：為比吸收系數（吸光系數）， L ：液層厚度，通常為 1cm.
如果溶液中有數種吸光物質，則此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。今欲測定葉綠體色素混合提取液中葉綠素 a 、 b 和類胡蘿卜素的含量，只需測定該提取液在三個特定波長下的吸光度 D ，并根據葉綠素 a 、 b 及類胡蘿卜素在該波長下的吸光系數即可求出其濃度。
葉綠素 a 、 b 的丙酮溶液在可見光范圍內的最大吸收峰分別位于紅光區(qū)和藍紫光區(qū)，為了排除類胡蘿卜素的干擾，所用單色光的波長選擇葉綠素在紅光區(qū)的最大吸收峰。
已知葉綠素 a 、 b 的 80 ％丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為 663nm 和 645nm ，又知在波長 663nm 下，葉綠素 a 、 b 在該溶液中的吸光系數分別為 82.04 和 9.27 ，在波長 645nm 下分別為 16.75 和 45.60 ，可根據加和性原則列出以下關系式：
D 663 ＝ 82.04Ca ＋ 9.27Cb(1)
D 645 ＝ 16.75Ca ＋ 45.60Cb （ 2 ）
式（ 1 ）、（ 2 ）中的 D 663 和 D 645 為葉綠素溶液在波長 663nm 和 645nm 時的吸光度， Ca 、 Cb 分別為葉綠素 a 和 b 的濃度，以 mg ／ L 為單位。
解方程組（ 1 ）、（ 2 ），得：
Ca=12.7D 663 – 2.69 D 645 （ 3 ）
Cb=22.9 D 645 – 4.68D 663 （ 4 ）
將 Ca 與 Cb 相加即得葉綠素總量 Ct ：
Ct=Ca+Cb=20.2 D 645 +8.02 D 663 （ 5 ）
由于葉綠素 a 、 b 在 652nm 的吸收峰相交，兩者有相同的比吸收系數（均為 34.5 ），也可以在此波長下測定一次吸光度（ D 652 ）而求出葉綠素 a 、 b 總量：
Ct= Ca+b=D 652 × 1000/34.5 （ 6 ）
丙酮提取液中類胡蘿卜素的含量： Ck=4.7D 440 - 0.27Ca+b
由于葉綠體色素在不同溶劑中的吸收光譜有差異，因此，在使用其他溶劑提取色素時，計算公式也有所不同。
[ 實驗材料 ]
新鮮植物葉片。
[ 儀器設備 ]
研缽，漏斗，滴管，大試管（帶膠塞），大頭針，濾紙，天平，量筒，毛細管。
試管，試管架，燒杯，酒精燈，玻棒，鐵三角架，刻度吸量管，火柴，
分光光度計，容量瓶，定量濾紙。
[ 藥品試劑 ]
95 ％乙醇、 80 ％丙酮、石英砂、碳酸鈣粉、醋酸銅粉末
推動劑：按石油醚： 乙醚（ 4 ： 1 ）（ V ／ V ）。
KOH- 甲醇溶液： 30gKOH 溶入 100mL 甲醇中，過濾后盛于塞有橡皮塞的試劑瓶中。
[ 實驗步驟 ]
（一）葉綠體色素的提取
（ 1 ）取植物新鮮葉片 1 克，洗凈，擦干，去掉中脈剪碎，放人研缽中。
（ 2 ）研缽中加入少量石英砂及碳酸鈣粉，加 2 ～ 3mL100% 丙酮，研磨至糊狀，再加 5mL100 ％丙酮，過濾，即得色素提取液。
（ 3 ）如無新鮮葉片，也可用事先制好的葉干粉提取。取新鮮葉片，先用 105 ℃殺青，再在 80 ℃下烘于，研成粉末，密閉貯存。用時稱葉干粉 1.5 克放人小燒杯中，加 3mL100% 丙酮浸提，并隨時攪動。待乙醇呈深綠色時，濾出浸提液備用。
（二）葉綠體色素的分離
? 點樣：取前端剪成三角形的濾紙條，用毛細管取葉綠素提取液，如圖點樣于“色點”處，注意每次所點溶液不可過多，點樣后晾干，再重復操作數次。
? 分離：在大試管中加入推動劑，然后將濾紙固定于膠塞的小鉤上，插入試管中，使尖端浸入溶劑內（色點要高于葉面，濾紙條邊緣不可碰到試管壁），蓋緊膠塞，直立于陰暗處層析。
當推動劑前沿接近濾紙邊緣時，取出濾紙，風干，觀察色帶的分布。葉綠素 a 為藍綠色，葉綠素 b 為黃綠色，葉黃素為黃色，胡蘿卜素為橙黃色。用鉛筆標出各種色素的位置和名稱。
（三） 將上一個實驗中提取的葉綠體色素溶液適當稀釋后，進行以下實驗：
（ 1 ）熒光現象的觀察。
取 l 支試管加入濃的葉綠體色素提取液，在直射光下觀察溶液的透射光與反射光顏色有何不同，可觀察到反射出暗紅色的熒光。
（ 2 ）氫和銅對葉綠素分子中鎂的取代作用
方法一；取兩支試管。第一支試管加葉綠體色素提取液 2mL ，作為對照。第二支試管加葉綠體色素提取液 2 mL ，再加入 50 ％醋酸數滴，搖勻，觀察溶液顏色變化。當溶液變竭后，再加入少量醋酸銅粉末，微微加熱，觀察記錄溶液顏色變化情況，并與對照試管相比較。解釋其顏色變化原因。
方法二；另取醋酸一醋酸銅溶液 20mL ，置于燒杯中。取新鮮植物葉兩片，放入燒杯中，用酒精燈慢慢加熱，隨時觀察并記錄葉片顏色的變化。當葉片變褐時，取出一片葉，余下一片繼續(xù)加熱，直至顏色不再變化為止。解釋原因。
（ 3 ）皂化作用（綠色素與黃色素的分離）
取葉綠體色素提取液 2 mL 于大試管中，加入 4mL 乙醚，搖勻，再沿試管壁慢慢加人 3 ～ 6mL 蒸餾水，輕輕混勻，靜置片刻，溶液即分為兩層，色素已全部轉入上層乙醚中。用滴管吸取上層綠色層溶液，放入另一試管中，再用蒸餾水沖洗一、二次。在色素乙醚溶液中加入 30 ％ KOH －甲醇溶液，充分搖勻，靜置?？梢钥吹饺芤褐饾u分為兩層，下層是水溶液，其中溶有皂化的葉綠素 a 和 b ，上層是乙醚溶液，其中溶有黃色的胡蘿卜素和葉黃素。將上下層放入兩試管中，可供觀察吸收光譜用。
（ 4 ）葉綠體色素吸收光譜曲線
將上述葉綠體色素提取液注入 1cm 比色杯中，另取 95% 乙醇作空白，于 400-700nm 之間，每間隔 10nm 讀取光密度值。根據測定結果，以波長為橫坐標繪制曲線，此即葉綠體色素的吸收光譜曲線。用同樣的方法測定皂化作用中分離出綠色素與黃色素的吸收光譜曲線，并對結果進行分析。
（四）葉綠體色素的含量測定
（ 1 ）取新鮮植物葉片，擦凈組織表面污物，剪碎，混勻。
（ 2 ）稱取剪碎的新鮮樣品 0.5g ，放入研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及 2 ～ 3mL80 ％丙酮，研成勻漿，再加 80 ％丙酮 5mL ，繼續(xù)研磨至組織變白。
(3 ）轉移到 25mL 棕色容量瓶中，用少量 80 ％丙酮沖洗研缽、研棒及殘渣數次，最后連同殘渣一起倒入容量瓶中。最后用 80 ％丙酮定容至 25mL ，搖勻。離心或過濾。
(4 ）將上述色素提取液倒入光徑 1cm 的比色杯內。以 80 ％丙酮為空白，在波長 663nm 、 645nm 、 652nm 和 440nm 下測定光密度。
（五）結果計算
將測得的光密度值代入公式，分別計算葉綠素 a 、 b 、 a+b 和類胡蘿卜素的濃度（ mg ／ L ）。
并按下式計算組織中單位鮮重或干重的各色素的含量：
色素含量（ mg/g （ fw ）） = 色素濃度（ mg/L ） χ 提取液總體積（ mL ） / 樣品重量（ g ） χ 1000
注意事項 ]
? 為了避免葉綠素光分解，操作時應在弱光下進行，研磨時間應盡量短些
（ 2 ）葉綠體色素提取液不能混濁
提取
葉綠素提取的準備工作是在一個半暗的房間里，室溫保持在25℃。提取步驟如下：
(1) 取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。
(2)將粉碎的1000克綠葉放進加有少量的碳酸鈣的丙酮中(溫度20℃)進行萃取，直到過濾、清洗后的葉子碎片為無色。
(4)將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最后得到黃綠色懸浮液。
(5)用無水硫酸鈉對懸浮液進行干燥，并將其滲入到3cm厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉類胡蘿卜素，使之只含有天然的葉綠素。
(6)含有天然葉綠素的蔗糖柱分兩層，綠層有4-10mm的葉綠素b層，另一藍層為2-6mm的葉綠素a層。
(7)將位于藍層正中的部分(約占藍層的一半) 放入醚中，對此懸浮液進行過濾、洗提，用蒸餾水清洗，用硫酸鈉干燥，再用器皿進行過濾后，得到葉綠素a。
(8)將(6)中的綠層中間部分移出，迅速放入醚中過濾、洗提，制成葉綠素b醚溶液。
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